[發明專利]人外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的分選擴增方法

在審

• 申請號: 201510059318.1
• 申請日: 2015-02-04
• 公開（公告）號: CN104651309A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 張建平;陳慧;祝麗瓊;劉梅蘭;劉玉昆;譚劍平;陳立斌;劉穎琳;王蘊慧;張睿
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明屬于細胞分選擴增領域，特別涉及一種人外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的分選擴增方法。

背景技術

CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Regulatory?T?cell，Treg)是一種具有免疫調節功能的細胞群，可通過抑制自身反應性T細胞的免疫反應、抑制傳統T細胞的活化以及促進一些抑制性細胞因子的分泌等，在維持機體內環境的穩定、誘導移植物的耐受中發揮重要作用，是機體內以主動方式獲得和維持自身耐受的一種重要方式。1995年，Sakaguchi等首次報道了在自身免疫耐受中存在一類表達IL2受體a鏈(IL2Ra，CD25)的T細胞亞群，并將這類CD4+CD25+T細胞命名為調節性T細胞(Regulatory?T?cell，Treg)。隨后研究發現，Treg是一種具有免疫調節功能的細胞群，它能分泌IL-10、TGF-B.表達Foxp3及CTLA-4分子等，通過細胞間直接接觸或細胞因子間接方式抑制自身反應性T細胞的免疫反應、抑制傳統T細胞的活化以及促進一些抑制性細胞因子的分泌等，在維持機體內環境的穩定、誘導移植物的耐受中發揮重要作用，是機體內以主動方式獲得和維持自身耐受的一種重要方式，并與免疫調節、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、移植免疫耐受、母胎免疫耐受等諸多方面有著密切的聯系。因此，Treg細胞是目前國內外研究的熱點。但目前對T?reg細胞的功能和發揮抑制作用的免疫學機制尚未得到完全闡明，對Treg細胞的免疫學特性有必要進一步深入研究。而體外成功分離和培養該細胞，將是對其免疫學特性行進一步研究的必要條件。

隨著對CD4+CD25+Foxp3+調節性Treg細胞的深入研究，其臨床應用潛能一直是目前研究的熱點。然而，CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞僅占正常人外周血CD4+T淋巴細胞的5％-10％，其數量極少，必須能夠在體外大量擴增才能滿足科研及臨床應用的需要。免疫磁珠細胞分選技術(MACS)是本世紀80年代發展起來的一種高效的細胞分離方法，其基本原理是：根據細胞表面抗原能和連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結合，將其置于外加強磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在強磁場中，沒有此種表面抗原的細胞由于不能和連接著磁珠的特異性單克隆抗體結合而無磁性，在強磁場中不滯留，從而分離出目的細胞。該技術并且不需要大型的儀器設備，容易進行無菌操作，對細胞的功能活性影響很小，提取分離后可以進行體外培養，因此在對特定細胞亞群的功能研究中得到了廣泛的應用。

因此運用免疫磁珠細胞分選技術(MACS)研制一種人外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的分選擴增方法具有重要意義。

發明內容

為克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種人外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的分選擴增方法。本發明采用免疫磁珠分選法(MACS法)成功分選出高純度的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞，并利用CD3/CD28單抗包被的Dynalbeads聯合IL2共同刺激CD4+CD25+Treg細胞，成功擴增了高純度的Treg細胞。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種人外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的分選擴增方法，具體步驟如下：

1)外周血單個核細胞(PBMC)的分離

抽取肝素抗凝靜脈血30ml，取6個15ml管離心管，每管小心加入淋巴細胞分離液5ml，將5ml外周血沿管壁緩慢置于淋巴細胞分離液層面之上，2000轉/分20℃離心20min，收集淋巴細胞層中的淋巴細胞，PBS洗滌2次備用；

2)CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞MACS分選