[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510058622.4
• 申請(qǐng)日: 2015-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN104630387B
• 公開（公告）日: 2017-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃小波;曹三杰;朱書權(quán);文心田;文翼平;伍銳;梁恩濤;段素芬;張丹;張小會(huì)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉病在豬群中的傳播速度較豬傳染性胃腸炎慢，死亡率也較低，但最近一兩年報(bào)道，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)發(fā)生變異，死亡率有所增高。哺乳仔豬感染豬流行性腹瀉病毒的主要臨床癥狀為：發(fā)生水樣腹瀉并伴有嘔吐而導(dǎo)致嚴(yán)重脫水、消瘦、眼窩下陷等癥狀；糞便較稀，顏色為黃色或灰白色，嘔吐多發(fā)生于吃奶或進(jìn)食后；發(fā)病豬只一般在5天左右死亡，有的豬場(chǎng)哺乳仔豬的死亡率可高達(dá)90％。斷奶仔豬與保育豬感染流行性腹瀉病毒后癥狀較輕，常呈現(xiàn)精神沉郁、厭食、拉稀、嘔吐等臨床癥狀，如護(hù)理得當(dāng)，豬場(chǎng)比較潔凈，無其它疾病續(xù)發(fā)感染，則死亡率較低，約在10％-20％；育肥與后備豬感染呈現(xiàn)一過性特點(diǎn)，很少發(fā)生死亡，一般3-7天可以自然康復(fù)。剖檢的主要病理變化主要小腸極度膨脹，腸壁呈半透明狀，腸系膜淋巴結(jié)水充血，胃充滿白色乳凝塊，小腸內(nèi)容物稀薄，含有大量的淡黃色液體，小腸絨毛縮短。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如病毒分離鑒定和血清檢查，往往耗時(shí)過長(zhǎng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是眾多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)(the nucleic acid amplifications tests，NATs)中的一種。自從Notomi等研究者于2000年公布該技術(shù)以來，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，其中就包括對(duì)病原體感染的檢測(cè)。當(dāng)研究者將該技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)各種病原體的同時(shí)，也對(duì)該技術(shù)提出了很多的改進(jìn)，使得該技術(shù)逐步完善，能夠成功地被應(yīng)用于如瘧疾、錐蟲病、泰勒爾梨漿蟲病和巴貝蟲病等疾病病原體的檢測(cè)。LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行的，不需要特殊的儀器，可以肉眼觀察結(jié)果，操作簡(jiǎn)單。

鄭新添等，“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014年10月第36卷第10期，公開了一種采用RT-LAMP檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的方法，其能夠檢測(cè)的豬流行性腹瀉病毒的最低檢測(cè)限度為16copies/μL。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的可檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的試劑盒。

本發(fā)明檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增豬流行性腹瀉病毒的基因。

其中，所述試劑盒還包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述試劑盒還包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制備檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的試劑中的用途。

其中，所述檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的試劑是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增豬流行性腹瀉病毒的基因的試劑。

其中，所述試劑還包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

其中，所述試劑還包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制備環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增豬流行性腹瀉病毒的基因的試劑中的用途。

其中，所述試劑還包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述試劑還包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物，用LAMP技術(shù)可以特異有效地?cái)U(kuò)增豬流行性腹瀉病毒的基因，病毒的最低檢測(cè)濃度為15copies/μL，最低檢測(cè)限度略低于現(xiàn)有方法，靈敏度略高，同時(shí)，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，檢測(cè)快速，具有良好的應(yīng)用前景。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1 dNTPs對(duì)LAMP的影響。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次對(duì)應(yīng)dNTPs的劑量為:0.5、1.0μL、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL。

圖2 MgSO4對(duì)LAMP的影響。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次對(duì)應(yīng)MgSO4的劑量為:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL。

圖3 Bst DNA聚合酶對(duì)LAMP的影響。M:DL2000DNA Marker；泳道1-9依次對(duì)應(yīng)Bst大片段DNA聚合酶的劑量為:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL。