[發明專利]用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針、試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 201510058194.5
• 申請日: 2015-02-04
• 公開（公告）號: CN104561388A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 郭志勛;孫秀秀;崔亞婷;馮娟;馬紅玲;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 高東陽

1.一種用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針，其特征在于，所述的核酸探針為地高辛標記的核酸片段，該核酸片段的5’端和3’端之間的基因序列如SEQIDNo.1所示。

2.含權利要求1所述的用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒由多個試劑瓶和NC膜組成，所述的試劑瓶包括下述組分，用于檢測青蟹雙順反子病毒-1核酸的A液，用于促進探針結合的B液，用于消化包圍靶RNA蛋白質的C液，用于組織蛋白非特異結合位點封閉的D液，用于與沒有雜交的探針結合的E液，用于顯色的F液，用于洗去雜質的G液；

其中：所述的A液為地高辛標記的核酸探針。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的B液為雜交液。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的C液為蛋白酶K。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的D液為10×封閉液。

6.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的E液為堿磷酶標記的地高辛抗體。

7.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的F液NBT/BCIP儲液。

8.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的G液為TE緩沖液。

9.用權利要求2所述的試劑盒檢測青蟹雙順反子病毒-1的斑點雜交方法，其特征在于，該方法依次包括下述步驟：

1)將NC膜用2×SSC液浸透，取出后晾干；

2)將病毒樣品RNA放PCR儀中變性后，立即放入冰上；

3)將變性后的病毒RNA點樣于步驟1)的NC膜上，120℃烤膜30min；

4)將步驟3)烤后的NC膜放入B液中預雜交30min；

5)用B液將A液稀釋至25ng/mL后煮沸變性，立即置于冰上冷卻；

6)將步驟4)預雜交好的NC膜轉移到步驟5)中制備的探針雜交液中，孵育過夜；

7)將步驟6)雜交好的NC膜在室溫下清洗，再用緩沖液中漂洗；

8)將D液用馬來酸緩沖液稀釋后制成封閉溶液工作液，將NC膜放入封閉溶液，靜置；

9)用步驟8)的封閉溶液工作液將E液稀釋后，制成抗體溶液工作液，然后將NC膜放入抗體溶液工作液中，靜置；

10)將步驟9)的NC膜放入洗滌緩沖液中洗滌后放入檢測緩沖液中平衡；

11)向F儲液加入檢測緩沖液中混勻制備底物顯色液，然后滴加在NC膜上中避光顯色過夜；顯色后用G液洗NC膜，結果掃描或拍照。

10.用權利要求2所述的試劑盒檢測青蟹雙順反子病毒-1的原位雜交方法，其特征在于，該方法依次包括下述步驟：

1)組織切片上滴加C液，37℃消化20min；PBS漂洗后，用多聚甲醛液固定后漂洗；

2)將玻片用變性液78℃變性8min，立即放入-20℃預冷的乙醇梯度中；

3)用B液將A液稀釋后滴加在步驟2)完全風干后的玻片上，雜交過夜；

4)漂洗步驟3)的玻片；

5)將D液用馬來酸緩沖液稀釋后制成封閉溶液工作液，滴加在步驟4)的玻片上靜置；

6)用封閉溶液工作液將E液稀釋，制成抗體溶液工作液，然后滴加到步驟5)處理后的玻片上，靜置；

7)將步驟6)玻片放入洗滌緩沖液中漂洗后放入檢測緩沖液中平衡；

8)向F液加入檢測緩沖液中混勻制備底物顯色液，將步驟7)的玻片放入底物顯色液中避光顯色；

9)用G液浸泡步驟8)的玻片后復染，再次洗滌后快速脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。