[發(fā)明專利]一種檢測水產(chǎn)植酸酶活性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510055479.3
• 申請日: 2015-02-03
• 公開（公告）號: CN104614366A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧玉標;徐樹德;周銀華;張濤;唐啟峰;杜紅方;史寶軍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/75
• 分類號: G01N21/75;G01N21/31
• 代理公司: 北京法思騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測水產(chǎn)植酸酶活性的方法。

背景技術(shù)

植酸酶是能夠依次分解植酸分子中的磷，將植酸(鹽)降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸(鹽)結(jié)合的其它營養(yǎng)物質(zhì)的一類酶的總稱。由于植酸酶能夠分解飼料的植酸為肌醇和無機磷，提高飼料中磷的利用率，減少無機磷的用量，降低植酸及其植酸鹽對蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素的螯合作用，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，并減少植酸對動物腸胃內(nèi)相關(guān)消化酶的活性的抑制作用，最終提高動物的生產(chǎn)性能，降低磷對環(huán)境的污染作用。自20世紀80年代開始在飼料中推廣應(yīng)用以來，已有2/3以上的畜禽飼料中都使用了植酸酶，其使用效果已得到廣大從業(yè)人員的認可。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物在生理上和飼料上的復(fù)雜性與特殊性，長期以來植酸酶在水產(chǎn)飼料中的研究與應(yīng)用進展較為緩慢，但磷酸二氫鈣是不可再生資源，隨著其日益開采，其產(chǎn)量會越來越低，價格勢必會不斷上漲，這定會加速水產(chǎn)飼料中植酸酶使用的進程。此外，水產(chǎn)養(yǎng)殖中磷污染的日益加重，低污染養(yǎng)殖的呼聲也越來越高，這也會進一步地推動植酸酶在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用。

植酸酶活性的測定方法最常用的是分光光度法，其原理是在一定溫度和pH條件下，植酸酶可將底物植酸鈉水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中與釩鉬酸銨生成黃色的復(fù)合物，于波長415nm下進行比色測定。目前已形成國標GB/T18634-2009《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》，其酶活定義為：在pH?5.50、溫度37℃下，每分鐘催化5.0mmol/L植酸鈉溶液水解釋放1μmol無機磷所需的酶量即為一個植酸酶活性單位，即該方法的檢測標準是pH?5.50、溫度37℃，只適用于檢測在畜禽飼料中使用的酸性植酸酶，而不適用于檢測在水產(chǎn)飼料中使用的植酸酶。因此，目前急需開發(fā)一種檢測應(yīng)用于水產(chǎn)飼料植酸酶活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測水產(chǎn)植酸酶活性的方法。

根據(jù)本發(fā)明的檢測水產(chǎn)植酸酶活性的方法包括以下步驟：

(1)酶制劑待測樣液的制備

稱取水產(chǎn)植酸酶樣品，加入0.1mol/L?pH值至6.5的Bis-Tris緩沖液，制備濃度0.03～0.06U/ml的酶制劑待測樣液制備；

(2)制備底物溶液：7.5mmol/L?pH6.5的植酸鈉溶液；

(3)反應(yīng)

向比色管中加入酶制劑待測樣液和底物溶液，25℃下反應(yīng)；

(4)吸光值測定

將反應(yīng)后的樣液混勻，在分光光度計415nm波長處，測定對照管A₀和樣品管A的吸光值，A-A?₀為實測吸光值，用直線回歸方程計算無機磷含量，根據(jù)無機磷含量計算植酸酶活性；

(5)結(jié)果計算

樣品中植酸酶活性以Y表示，單位為酶活性單位每克U/g或酶活性單位每毫升U/ml，按下式計算：

Y＝(C×n)÷(m×30)

式中：C表示由實測吸光值代入直線回歸方程計算的無機磷含量；

n為水產(chǎn)植酸酶樣品反應(yīng)前總稀釋倍數(shù)；

m為水產(chǎn)植酸酶樣品的量，單位為g或ml。

根據(jù)本發(fā)明的方法，使用在近中性環(huán)境有很好緩沖能力的Bis-Tris緩沖液，以確保水產(chǎn)植酸酶活性是在近中性條件下測定的，保證測定結(jié)果的準確性。

根據(jù)本發(fā)明的方法，對于飼料樣品中植酸酶活性的測定，使用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液來提取，可以降低飼料樣品中可溶解的無機磷含量，從而減少對酶活測定的干擾，減小測定誤差。

根據(jù)本發(fā)明的方法，通過減小待測樣液的濃度，加大反應(yīng)體系中樣液的加樣體積，可以減小測定誤差。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，檢測水產(chǎn)植酸酶活性的方法，包括如下步驟：

1溶液配制

1.1Bis-Tris緩沖液(0.1mol/L)：稱取20.92g?Bis-Tris，0.0167g牛血清白蛋白于1000ml燒杯中，加入900ml蒸餾水攪拌溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.50，轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中并用蒸餾水定容至刻度；

1.2碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(0.1mol/L)：分別配制0.1mol/L的碳酸鈉和碳酸氫鈉溶液，按碳酸鈉與碳酸氫鈉溶液體積比為9:1的比例混合；