[發明專利]動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法

在審

• 申請號: 201510055264.1
• 申請日: 2015-02-03
• 公開（公告）號: CN104849359A
• 公開（公告）日: 2015-08-19
• 發明（設計）人: 辛蕊華;李維;鄭繼方;羅永江;謝家聲;王貴波;羅超應;李錦宇
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

技術領域

本發明涉及一種使用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)測定動物血清中次野鳶尾黃素含量的方法，屬于藥物分析領域。

背景技術

射干是鳶尾科射干屬植物射干的干燥根莖，為常用藥材，具有清熱解毒、利咽祛痰的功效，臨床主要用于咽喉疼痛、痰咳氣喘等癥。次野鳶尾黃素是射干中重要的異黃酮類成分之一，也是藥典中評價射干藥材質量的標示性成分。目前，次野鳶尾黃素的含量測定多見于體外測定，而在動物體內血藥濃度的檢測方法尚未見報道。近年來，越來越多的研究表明射干中次野鳶尾黃素等異黃酮類物質具有多種藥理作用，如抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及抗炎等活性，而次野鳶尾黃素在動物體內的吸收、分布、代謝及排泄過程有待進一步研究，因此，次野鳶尾黃素在血清中的含量測定方法亟需研究。

液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)聯用技術是二十世紀九十年的發展起來的一門綜合分析技術，LC的高分離效能與MS的高靈敏度、高選擇性使其成為當代最重要的分離和鑒定分析方法之一,同時近年來也成為藥物研究中最可靠實用的分析手段。該分析技術需樣量少、檢測限低，尤其適用于藥物在機體代謝等因素的作用下所產生的分解物或代謝物的結構研究和量的變化。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種方便快捷、準確的檢測動物血清中次野鳶尾黃素的含量的方法。

本發明的目的通過以下技術方案來具體實現：

一種動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，將高效液相色譜-質譜聯用技術應用于動物血清中次野鳶尾黃素的含量測定，以山奈酚為內標，測定動物血清中次野鳶尾黃素的含量。

作為優選方案，上述的動物血清中次野鳶尾黃素含量的測定方法，具體步驟如下：

1)標準品溶液及內標液的配制

精密稱取次野鳶尾黃素標準品適量，用甲醇溶解并定容得到次野鳶尾黃素標準品溶液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容得到內標溶液；

2)標準血清溶液的制備

向動物空白血清中加入次野鳶尾黃素標準品溶液、內標溶液，渦旋混合，加NaCl，渦旋混勻，加乙酸乙酯，充分渦旋混勻，離心分離有機層，于40℃水浴中氮氣吹干，加超純水溶解殘渣，過微孔濾膜，得標準血清溶液；

3)供試品溶液的制備

取給藥后的動物血清，加入內標溶液，渦旋混合，加入NaCl，渦旋混勻，加乙酸乙酯，充分渦旋混勻，離心分離有機層，于40℃水浴中氮氣吹干，加超純水溶解殘渣，過微孔濾膜，得供試品溶液；

4)測定

分別吸取標準血清溶液和供試品溶液各2μl，用微孔濾膜過濾后進HPLC-MS/MS分析。

進一步優選的，所述步驟2)中，空白血清：次野鳶尾黃素標準品溶液：內標溶液：NaCl：乙酸乙酯為0.5ml：10μL：10μL：0.1g：2mL。

進一步優選的，所述步驟3)中，空白血清：內標溶液：NaCl：乙酸乙酯為0.5ml：10μL：0.1g：2mL。

進一步優選的，所述微孔濾膜有孔徑為0.22μm。

進一步優選的，所述步驟4)中，測定條件為：

色譜條件：C₁₈反相色譜柱；流動相：乙腈和0.1％甲酸水溶液，二元梯度洗脫；柱溫30℃；進樣體積為2uL；

色譜條件：采用電噴霧電離源；毛細管電壓為4kv；霧化溫度：350℃；霧化氣：50kPa；干燥氣體流速：10L·min^-1；碰撞能量：48v；掃描方式為多反應監測。

所述梯度洗脫的程序優選為：0min→2min→6min→10min→15min、乙腈15％→25％→40％→80％→15％；流速為0.4mL·min^-1。

進一步優選的，所述步驟4)中，測定后，根據得到的總離子流圖和質譜圖，測定峰面積，以次野鳶尾黃素和內標的峰面積比為Y軸對血清中次野鳶尾黃素濃度為X軸進行線性回歸，得線性關系和回歸方程，計算待測物濃度。

進一步優選的，所述步驟1)，具體為：精密稱取次野鳶尾黃素標準品適量，用甲醇溶解并定容得到0.1μg·ml^-1次野鳶尾黃素溶液；精密稱取山奈酚適量，用甲醇溶解并定容得到0.1μg·ml^-1內標溶液。

上述所述動物可為家兔、鼠及禽類等。