[發明專利]一種檢測水體細菌數量的熒光顯微計數方法

有效

• 申請號: 201510055148.X
• 申請日: 2015-02-03
• 公開（公告）號: CN104593475B
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 沙茜;朱志超;柯文彪;何君;周帆琦
• 申請（專利權）人: 武漢市環境保護科學研究院
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 常海濤

1.一種用于熒光顯微鏡細菌計數的抗褪色劑，其特征在于：每200mL該抗褪色劑的儲備液通過包含如下步驟的方法制備得到：將2g對苯二胺、0.8g氯化鈉、3.2g磷酸氫二鈉、0.25g Tris、4g甘氨酸溶于80mL去離子水中，用0.1M的鹽酸或氫氧化鈉調節pH至7.2，加入100mL甘油，最后用去離子水定容至200mL。

2.根據權利要求1所述的用于熒光顯微鏡細菌計數的抗褪色劑，其特征在于：該抗褪色劑的工作液為將儲備液用無菌針頭濾器過濾除菌再用無菌水稀釋后得到。

3.根據權利要求2所述的用于熒光顯微鏡細菌計數的抗褪色劑，其特征在于：將儲備液稀釋10倍得到工作液。

4.權利要求1-3任一項所述的抗褪色劑在熒光顯微鏡細菌計數中的應用。

5.一種檢測水體細菌數量的熒光顯微計數方法，其特征在于包括如下步驟：往水樣中加入熒光染料進行染色，再加入權利要求2或3所述的抗褪色劑的工作液進行抗褪色處理，將抗褪色處理的樣品經醋酸纖維濾膜抽濾后在熒光顯微鏡下觀察。

6.根據權利要求5所述的檢測水體細菌數量的熒光顯微計數方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)樣品染色：取1mL水樣到5mL的離心管中，加入100μL用無菌去離子水稀釋的SYBR Green I熒光染料，避光染色5min；

(2)抗褪色處理：向步驟(1)染色好的樣品中加入其3倍體積的權利要求2或3所述的抗褪色劑的工作液，混勻后避光靜置5min；

(3)熒光顯微計數：將步驟(2)經抗褪色處理的樣品利用真空抽濾裝置進行過濾，所用濾膜為普通醋酸纖維濾膜，孔徑0.22μm；過濾完畢后，將濾膜取出放置到載玻片上，使附有細菌的一面朝上，然后在濾膜上滴加一滴權利要求2或3所述的抗褪色劑的工作液，覆上蓋玻片，置熒光顯微鏡載物臺上，以480nm光波激發，40倍物鏡下觀察，隨機計數10個視野中細菌顆粒的數量，并計算平均數；最后按公式Y＝AB/C計算出1mL樣品中細菌的數量，其中Y表示1mL樣品中細菌的數量，A表示一個視野中細菌的平均數，B表示濾膜截留面積，C表示每個視野的面積。