[發(fā)明專利]一株牛支原體NADH氧化酶的單克隆抗體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510054798.2
• 申請日: 2015-02-01
• 公開（公告）號: CN104726413B
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭愛珍;趙剛;陳曦;汪乾坤;張慧;郭雨絲;陳穎鈺;胡長敏
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;G01N33/573
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物傳染病防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株牛支原體NADH氧化酶的單克隆抗體及應用。該單克隆抗體是由交瘤細胞株8B7分泌的，所述的NADH氧化酶是一種牛支原體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,簡稱NOX)。

背景技術(shù)

牛支原體(Mycoplasma bovis,簡稱M.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是導致我國牛呼吸綜合征的主要病原體，主要臨床癥狀為肺炎，還可導致乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、結(jié)膜炎、中耳炎等多種癥狀。剖檢病理變化主要集中在胸腔與肺部，表現(xiàn)為肺和胸膜發(fā)生不同程度的粘連并有少量積液。牛支原體于1961年首次在美國從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到，1976年證實其是導致肺炎的重要病原體。此后，牛支原體肺炎和乳腺炎已給歐、美各國造成了巨大的經(jīng)濟損失(Caswell等，2010；White等，2010)。據(jù)估計，歐洲每年約有25％～33％的犢牛肺炎是由牛支原體引起的，相當于每年損失1.44～1.92億歐元,其中英國每年就有190萬頭牛患牛支原體肺炎，死亡達15.7萬頭。美國每年由于牛支原體導致的牛呼吸系統(tǒng)疾病和乳腺疾病所造成損失達1.40億美元,牛場感染率可達70％。

隨著我國養(yǎng)牛業(yè)向規(guī)模化和集約化發(fā)展，牛養(yǎng)殖量大大增加，專門化程度大幅度提高，肉牛“異地育肥”已成為重要的肉牛養(yǎng)殖模式。長距離運輸是“異地運輸”的重要環(huán)節(jié)，運輸應激可誘發(fā)多種重要疫病，牛支原體肺炎就是其中一種。2008年，湖北省從外地引進肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引進后2周左右發(fā)病，表現(xiàn)為發(fā)熱，咳嗽，流鼻涕，犢牛和體質(zhì)弱的牛發(fā)病嚴重。發(fā)病率為50％～100％。臨床治療周期長，效果差，病死率平均10％，可高達60％，給我國養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大損失。本實驗室于2008年率先確定該病為“傳染性牛支原體肺炎”(石磊等，2008)。隨后，不同研究群體均證實該病在全國廣泛流行(胡長敏等，2009；辛九慶等，2008)。此外，近年來奶牛乳腺炎致新生犢牛爆發(fā)牛支原體肺炎的事件也頻繁發(fā)生。在病原學和流行病學研究基礎(chǔ)上，本室完成了牛支原體HB0801的基因組序列解析(GenBank登錄號：CP002058)(Qi等,2012)。

牛支原體無細胞壁，對常用β內(nèi)酰胺類抗生素不敏感，對其它藥物如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)脂類和氟喹酪酮類等敏感藥物的耐藥性也在迅速增加(Mustafa等,2013)。迄今為止，尚無有效疫苗預防該病。因此，早期診斷和治療是控制該病的唯一方法。

目前該病的診斷方法主要有病原體分離鑒定、血清抗體檢測和核酸診斷三類。牛支原體的分離和鑒定，至少需要3天時間，分離需特殊營養(yǎng)，菌落觀察需在低倍顯微鏡下，支原體種的鑒定還需輔助PCR和/或測序方法；血清抗體檢測只能說明牛體感染過牛支原體，在流行病學調(diào)查中有意義，但不能作為牛支原病的診斷依據(jù)。針對牛支原體的PCR和等溫環(huán)介導方法靈敏度高，但前者需要特殊儀器設(shè)備和較高的實驗操作技能，且都容易因污染核酸而出現(xiàn)假陽性。因此，臨床上急需一種能檢測牛支原體抗原的檢測方法，獲得特異性高親合力的單克隆抗體是建立牛支原體抗原檢測方法的前提和基礎(chǔ)。當然，單克隆抗體還可在致病機理研究、治療藥物開發(fā)等方面具有廣泛的用途。

雖然國外和國內(nèi)先前都有報道研制成功牛支原體單克隆抗體，但單克隆抗體針對的抗原均為未知，限制了這些單克隆抗體的應用(Rasberry等，1992)。本申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室的課題組對牛支原體HB0801株進行了基因組測序分析(GenBank登錄號：CP002058)，結(jié)果表明，牛支原體是一種變異性極高的原核生物，針對牛支原體本地流行株表面相對保守、且免疫原性良好的蛋白抗原制備的單克隆抗體，將具有更為廣闊的應用前景。本發(fā)明從該指導思想出發(fā)，克隆表達了牛支原體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,簡稱NOX)；以重組rNOX免疫小鼠，獲得雜交瘤細胞，篩選獲得一株高親合力的單克隆抗體，經(jīng)過免疫印跡和免疫熒光實驗驗證該抗體特異性良好，靈敏度高，并具有牛支原體檢測能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種牛支原體表面保守蛋白rNOX的新型單克隆抗體，該單克隆抗體是一種牛支原體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,NOX)，由雜交瘤細胞株8B7分泌，該單克隆抗體可以特異、靈敏和穩(wěn)定地識別牛支原體。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種在體外條件下對牛支原體NOX單克隆抗體的抗原檢測方法，用于牛支原體的標記和臨床檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：