[發明專利]用于多重連接擴增技術的探針制備方法

有效

• 申請號: 201510054593.4
• 申請日: 2015-02-02
• 公開（公告）號: CN104694630B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 潘海波;華琴;邢楠楠
• 申請（專利權）人: 江蘇佰齡全基因生物醫學技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達

1.一種長探針的制備方法，包括如下步驟：

1)設計一對與待測目的基因及長探針核苷酸序列無關的通用檢測引物，分別為上游引物CF和下游引物CR；

2)合成左側短探針S，5’到3’序列分別由所述上游引物CF序列與目的片段左側序列TF組成；

3)確定一段與目的基因及通用引物無關的核苷酸序列T，設計一對擴增右側長探針的引物，分別為LF和LR，其中LF的5’到3’序列分別是由目的片段右側序列TR與所述T序列5’端的10-25bp堿基組成，LR的5’到3’序列分別由下游引物CR序列與所述T序列3’端的10-25bp堿基的反向互補序列組成，并且LF引物的5’端用生物素標記，LR引物的5’端磷酸化，所擴增的右側長探針的5’到3’序列依次包含TR、T和CR反向互補序列；

4)利用上述引物LF和LR，以所述的核苷酸序列T為模板進行PCR擴增，獲得5’端生物素標記的正義鏈以及5’端磷酸化標記的互補鏈形成的雙鏈核苷酸序列；

5)將純化后的上述雙鏈核苷酸序列與鏈霉親和素磁珠混合孵育，使5’端標記生物素的雙鏈核苷酸與磁珠特異性結合；

6)利用外切酶對5’端標記磷酸化的互補鏈DNA進行酶切；純化回收5’端標記生物素的正義鏈DNA，即目的片段的右側長探針；

或者，上述的步驟2)～4)由下列步驟2’)～4’)替代，以獲得目的片段的左側長探針：

2’)合成右側短探針Z，5’到3’序列分別由所述目的片段右側序列TR與下游引物CR的反向互補序列組成；

3’)確定一段與目的基因及通用引物無關的核苷酸序列T，設計一對擴增左側長探針的引物，分別為LF’和LR’，其中LF’的5’到3’序列分別是由上游引物CF序列與所述T序列5’端10-25bp堿基組成，LR’的5’到3’序列分別由目的片段左側序列TF的反向互補序列與所述T序列3’端10-25bp的反向互補序列組成，并且LF’引物的5’端標記生物素，LR’引物的5’端標記磷酸化，所擴增的左側長探針的5’到3’序列依次包含CF正向序列、T和TF；

4’)利用上述引物LF’和LR’，以所述的核苷酸序列T為模板進行PCR擴增，獲得5’端生物素標記的正義鏈以及5’端磷酸化標記的互補鏈形成的雙鏈核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，使用獲得的右側長探針與人工合成的左側短探針進行MLPA驗證；或者，使用獲得的左側長探針與人工合成的右側短探針進行MLPA驗證。

3.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，所述的右側長探針的TR序列或者左側長探針的TF序列的設計中引入了目的片段中存在的核苷酸突變、缺失或者重復位點。

4.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，步驟1)所述通用檢測引物是一對與人類基因組、長探針核苷酸序列及待測靶序列無關的序列。

5.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，步驟2)所述短探針為人工合成。

6.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，步驟3)或步驟3’)所述的一段與目的基因及通用引物無關的核苷酸序列T為長探針的可變序列，位于目的片段與通用引物之間，可獲得不同長度的探針鏈；步驟3)所述的引物LF和LR、以及步驟3’)所述的引物LF’和LR’均由根據目的片段序列設計的5’端或3’端和根據所述序列T設計的5’端或3’端組成。

7.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，步驟4)或者4’)獲得的雙鏈核苷酸序列經過純化后再與鏈霉親和素磁珠進行混合孵育；步驟5)獲得的純化后的雙鏈核苷酸序列與鏈霉親和素磁珠混合孵育，其中每1份重量份生物素標記的雙鏈核苷酸與1-30份重量份的鏈霉親和素磁珠混合，混合后需要回收孵育液進行電泳檢測以確認孵育完全并且無雙鏈核苷酸序列殘留。

8.根據權利要求1所述的長探針制備方法，其特征在于，步驟6)所述的外切酶為λ噬菌體核酸外切酶，酶切反應中需要回收酶切液進行電泳檢測以確認酶切完全并且無雙鏈核苷酸序列殘留；步驟5)及步驟6)回收純化磁珠后需進行PCR驗證以確認完全結合。