[發明專利]舞毒蛾CYP6B53基因dsRNA及其在無公害防治中的應用

在審

• 申請號: 201510054279.6
• 申請日: 2015-02-03
• 公開（公告）號: CN104561007A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 曹傳旺;孫麗麗;高彩球;王志英;張健;鄒傳山
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，涉及亞洲型舞毒蛾的細胞色素P450 CYP6B53基因dsRNA及其在防治亞洲型舞毒蛾中的應用。

背景技術

舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）是世界性的害蟲，分布廣，食性雜，據國外報道可危害300多種植物，國內報道可危害楊、柳、蘋果、樟子松、落葉松等500余種植物。舞毒蛾傳播快、繁殖量和取食量大，給林業生產造成重大經濟損失，目前對亞洲型舞毒蛾的防治，仍然是以化學殺蟲劑為主，但這些化合物容易引起害蟲抗藥性的形成和環境污染問題。盡管一些害蟲天敵、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但這些防治技術存在天敵飼養難、受氣候環境影響大、見效慢、效果不明顯等弊病，嚴重制約了舞毒蛾防治的發展。然而，隨著生物技術的迅猛發展，利用RNAi技術控制害蟲的危害已成為植物保護工作者研究的重點和熱點。Napoli（1990）首次發現RNAi現象，將外源基因引入矮牽牛內引起內源基因的沉默，當時把這種現象稱為“共抑制”。1998年，華盛頓Carnegine研究所的Andrew Fire和馬薩諸塞大學癌癥研究中心的Craig C. Mello闡述了基因沉默現象的本質，并定義了RNAi。由于RNAi具有高特異性的沉默技術，因而展示出了很大的潛力，并且作為一種新的方法來防治農業害蟲，已在農業害蟲防治中得到應用。一方面通過基因工程手段將害蟲靶標基因dsRNA轉入植物體內，當有害生物取食轉基因植物時，引發害蟲體內發生基因沉默失去功能，降低害蟲的取食能力，例如：Baum等（2007）通過轉基因玉米防治玉米根部害蟲玉米根葉甲Diabrotica virgifera飼喂表達ATP酶dsRNA的轉基因植物，導致玉米根葉甲發育遲緩和死亡率升高；Mao等（2007）研究發現棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）取食表達CYP6AE14的dsRNA轉基因棉花后，棉鈴蟲的P450基因表達量明顯降低，害蟲的食欲降低，生長發育遲緩，最后死亡。另一方面，通過篩選具有致死效應的siRNA（一般來源于生物體內參與重要生物化學途徑的候選基因），并用化學方法合成，可應用于新型的殺蟲劑生物農藥。基于RNAi技術具有特異性強、對人畜安全、對非靶標生物安全、無害蟲抗藥性等特點，解決了化學農藥長期施用導致“3R”這一難題。因此，RNAi技術將為害蟲防治開辟一條新途徑。

昆蟲在殺蟲劑脅迫下，通過誘導高表達酯酶、谷胱甘肽S轉移酶、細胞色素P450等方式來進行自身的保護。細胞色素P450酶系是廣泛存在于生物體中的一類代謝酶系，是一種多功能氧化酶，具有底物廣普性和功能多樣性的特點，而細胞色素P450是多功能氧化酶的重要組成部分，起著與底物結合以末端氧化酶的作用，可以代謝多種內源性化合物（保幼激素及其類似物和脂肪酸等）和外源性化合物（藥物、植物次生物質及其毒素等），對殺蟲劑的代謝是昆蟲產生抗藥性的主要機制。

目前，有關通過抑制細胞色素CYPB53基因轉錄水平來防治林木重要害蟲舞毒蛾及提高其對有機磷類殺蟲劑的敏感性未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種舞毒蛾CYP6B53基因dsRNA及其在無公害防治中的應用，利用分子生物學手段干擾舞毒蛾細胞色素CYP6B53基因，降低了昆蟲的生存能力，使其生長發育緩慢，提高了舞毒蛾對有機磷類殺蟲劑的敏感性，在舞毒蛾無公害防治中的應用具有廣闊的前景并為其他鱗翅目害蟲防治提供了理論依據。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種亞洲型舞毒蛾細胞色素P450 CYP6B53基因，其核酸序列如SEQ ID No.1所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，獲得方法如下：

根據NCBI數據庫中登陸號為KF853194.1的細胞色素P450序列，設計編碼區設計上游引物LdCYP6B53F:5’ ATGTTGTCAATTTATTTACCTATATTTCTCATAGTAGC 3’； LdCYP6B53R: 5’ ATTTGAAGATTTCCTCGGAACAAGTCTTACGTG 3’，通過PCR法擴增獲得如SEQ ID NO.1所示序列。

本發明以亞洲型舞毒蛾CYP6B53基因片段為模板，并設計特異的dsRNA引物對，通過MEGAscript RNAi試劑盒合成CYP6B53基因dsRNA，dsRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

上述CYP6B53 dsRNA在無公害防治中的應用，主要表現在以下兩方面：