[發明專利]蛋白配體和基因同時檢測試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201510050483.0
• 申請日: 2015-01-30
• 公開（公告）號: CN105018590B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 廖正宇;廖世奇;袁紅霞;馬瑾;黃睿
• 申請（專利權）人: 廖世奇
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;G01N33/53
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心62100
• 代理人: 張英荷

技術領域

本發明涉及一種核酸和蛋白同時檢測方法和檢測試劑盒的應用方法，尤其是涉及一種通過核酸信標配基將蛋白信號轉換成核酸信號完成蛋白和基因檢測統一，再利用實時定量-PCR進行同時檢測的方法，屬于蛋白核酸檢測領域，具體的說是蛋白配體和基因同時檢測試劑盒及應用。

背景技術

早期蛋白質檢測是以抗體同特定待檢物蛋白質的低解離常數和一定的特異性為基礎實現的檢測技術，該檢測技術中抗體捕捉方法是簡易、方便的篩選方法。以抗體捕捉法為例，是用抗原包被于固相支持物，然后用抗體去結合抗原，洗板去掉未結合的抗體，最后用和結合抗體特異識別的標記分子去檢測結合抗體，許多抗體捕捉法是利用間接法來檢測抗體。例如，檢測抗體是鼠抗體，檢測分子可能是帶檢測標記的兔抗鼠抗體。傳統的檢測標記包括放射性同位素，染料和作用于底物產生可檢測分子如色原的酶。

隨著基因技術應用的快速發展，在抗原抗體檢測方面已有較多的基因檢測技術。抗原捕捉檢測法是檢測樣品中有無抗原。首先抗體先結合到支持物上，然后抗原加入和抗體反應形成復合物，最后檢測復合物，也可以抗原抗體先反應形成復合物后，再結合到固相支持物上，然后檢測復合物。檢測方法中ELISA是廣為人知的免疫檢測法，還有抗體檢測法等。

實時定量PCR是更先進的PCR技術，已用于核酸分析。在實時PCR中，PCR擴增DNA是在非線性標記雙熒光雜交探針存在條件下進行，其中一種熒光染料用作報告分子，它的發射光譜被第二種熒光染料淬滅。實時PCR在鏈延伸時，利用Taq多聚酶5’核酸活性切割雜交探針，結果使報告熒光染料從淬滅染料中釋放出來，致報告分子發射峰值增加。整個反應實時監控。逆轉錄 –PCR也可應用。系列檢測系統用96孔熱循環儀可連續檢測每孔中PCR反應時的熒光譜，因此，可排除復制子試驗室污染。

核酸與蛋白質在細胞內相互作用是普遍現象。核酸能折疊形成二級結構和三級結構，這對其與蛋白質相互結合作用非常重要。通過使核苷酸序列多樣化而使體外檢測核酸蛋白質相互作用方法成熟。SELEX技術被用來分離所選靶目標的核苷酸配體，這些配體被稱為配基或適配體，意即核酸可以形成一定結構并適配入靶分子的口袋，SELEX技術就是利用該原理篩選靶分子配基的方法。

盡管上述進步顯著，但診斷方法仍需提高靈敏度，減少人工操作，改進動態監測以快速分析樣品中靶標的存在與否及對其定量。

發明內容

本發明提出一種通過實時定量-PCR擴增核酸信標和基因核酸分子，實施對配體和基因同時檢測的技術方法，對細胞、微生物、基因和蛋白質等組學的研究具有重要意義。

為實現上述目的，本發明所述的蛋白配體和基因同時檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中主要包括：所述試劑盒中主要包括：待測樣品、捕捉瓊脂磁珠試劑、洗滌液、檢測試劑、核酸提取試劑、檢測體系；

所述待測樣品含有被檢測蛋白配體和基因；

所述捕捉瓊脂磁珠試劑是瓊脂磁珠-捕捉靶分子抗體復合物；

所述洗滌液是0.01M PBS+0.05M MgCl₂+0.01Tween-20；

所述檢測試劑是0.01M核酸信標配基檢測分子+0.01M PBS+0.05M MgCl₂的混合溶液；

所述核酸提取試劑是體積比為含飽和酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）；

所述檢測體系為含有靶分子核酸信標配基和基因的Taqman探針和引物的常規檢測試劑。

本發明所述的蛋白配體和基因同時檢測試劑盒的應用，其特征在于：包括下述步驟：

(1)將捕捉瓊脂磁珠試劑加入到待測樣品；在37℃，45min孵育，使瓊脂磁珠-捕捉靶分子抗體復合物與待測樣品中的靶分子結合，然后利用磁性分離分離出磁珠與清液并分別吸出，然后用洗滌液洗滌磁珠3次，3min/次，形成待測復合物待用；

(2)再在上述步驟(1)中形成的待測復合物中加入檢測試劑，該檢測試劑中的核酸信標配基與靶分子結合形成捕捉瓊脂磁珠-靶分子-核酸信標配基結構，將未結合形成捕捉瓊脂磁珠-靶分子-核酸信標配基結構的分子洗掉，用洗滌液洗滌3次，3min/次，得到磁珠液待用；

(3)將完成上述步驟的磁珠液中加入步驟(1)分離吸出的清液，再利用核酸提取試劑提取核酸；

(4)將步驟（3）提取出的核酸進行擴增基因常規檢測；

(5)進行常規檢測。

所述待測樣品為血清、尿液、細胞液、菌液或內分泌液需靶分子和基因同時檢測的生物樣本中的一種。