[發明專利]一種重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制備方法

在審

• 申請號: 201510050370.0
• 申請日: 2015-01-30
• 公開（公告）號: CN104630251A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 李俊;徐江;陳永恒;陳林;閆寧寧;陳主初
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C07K14/46
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強;周棟

1.一種重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)優化MitTxα及MitTxβ的編碼序列，優化后的MitTxα的編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示，優化后的MitTxβ的編碼序列如SEQ?ID?NO.2所示；

(2)以優化后的MitTxα的編碼序列為基礎構建重組載體MitTxα-pET22b；以優化后的MitTxβ的編碼序列為基礎構建重組載體MitTxβ-pET22b；所述重組載體MitTxα-pET22b的序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述重組載體MitTxβ-pET22b的序列如SEQ?ID?NO.4所示；

(3)將重組載體MitTxα-pET22b和重組載體MitTxβ-pET22b轉化大腸桿BL21表達菌株，并制備MitTxα包涵體和MitTxβ包涵體；

(4)分別對MitTxα包涵體和MitTxβ包涵體進行復性；將復性后的MitTxα包涵體和MitTxβ包涵體分離純化，得到MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共價結合，得到重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述復性中，MitTxα包涵體的復性條件為：0.2M?Arg-HCl(pH?8.8),32mM?L-cys，1mM胱氨酸；MitTxβ包涵體的復性條件為：50mM?NDSB-201，0.2M?Arg-HCl(pH?8.8)；32mM?L-cys，1mM胱氨酸。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述MitTxα包涵體分離純化包括透析去沉淀、陽離子交換、分子篩層析的步驟；其中，透析時pH值調為5.0-5.5；MitTxα在mono?S?5/50洗脫電導為25ms/cm，在superdex7510/300上洗脫體積為17.80-18.2mL。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述MitTxβ包涵體分離純化包括透析棄沉淀、陰離子交換、陽離子交換、分子篩層析的步驟；其中，透析時pH值調至8.5-9.0，透析后用Mono?Q陰離子交換純化收集流穿的MitTxβ；Mono?Q的流穿MitTxβ再經pH5.0-5.5的NaAC透析后利用Mono?S進一步純化,洗脫電導為25ms/cm在superdex7510/300上洗脫體積為13.80-13.90mL。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共價結合是將MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白等比例混合，放置10—20min后過Superdex75柱子，洗脫體積為13.46-13.55mL時，得到重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

6.一種重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx優化編碼序列，其特征在于，所述重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx優化編碼序列包括如SEQ?ID?NO.1所示的MitTxα編碼序列和如SEQ?ID?NO.2所示的MitTxβ編碼序列；MitTxα編碼序列編碼的MitTxα蛋白的序列如SEQ?ID?NO.5所示，MitTxβ編碼序列編碼的MitTxβ蛋白的序列如SEQ?ID?NO.6所示，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白為重組珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的兩個亞基，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共價連接。