[發明專利]一種改良性能的纖維素內切酶Cel7B突變體

有效

• 申請號: 201510049724.X
• 申請日: 2015-01-30
• 公開（公告）號: CN104560922B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 姚禮山;宋鄉飛;王業飛;張樹軍;張雨;洪景波
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 周秀梅,李穎

技術領域

本發明涉及的是修飾的7家族糖苷水解酶，具體的來說是一種在高溫下有改良性能的纖維素內切酶Cel7B突變體。

背景技術

纖維素是地球上非常重要的可再生資源，由纖維素降解產生的糖可以用來發酵生成生物能源，化學品，及其他高附加值的產品。但是由于纖維素結構的復雜性，導致其高效水解糖化非常有挑戰性。纖維素酶是一系列能夠水解纖維素β-1,4糖苷鍵的酶總稱，包括纖維素外切酶，纖維素內切酶和β-葡糖苷酶。其中外切酶從纖維素鏈的端點剪切糖苷鍵并釋放主要產物纖維二糖，內切酶從纖維素表面隨機剪切以產生新的纖維素鏈末端，而β-葡糖苷酶則主要把纖維二糖轉化成葡萄糖。

絲狀真菌里氏木霉能夠分泌出大量的纖維素酶(>50g/L)，已經被成功應用于工業化生產。其分泌的纖維素酶主要包括：外切酶Cel7A(占總酶量50％)，Cel6A(20％),；內切酶Cel7B(15％),Cel5A(10％),Cel12A(1％),Cel45A(<1％)；葡糖苷酶，葡聚糖單氧化酶Cel61A(<1％)等。除了在生物能源轉化過程中的潛在應用，纖維素酶在動物飼料加工、紡織品洗滌、紙漿加工等方面等發揮重要作用。

動物飼料中的抗營養因子如木質纖維素阻礙了動物對飼料的有效消化。而纖維素酶的使用尤其是高溫纖維素酶的使用破壞木質纖維素的結構，從而促進動物對飼料中營養的吸收。另外纖維素酶把纖維素轉化成糖，為動物提供新的營養物質。

纖維素酶還可以用來處理紡織品，如織物軟化、棉布拋光、牛仔布的整染、以及紡織品的洗滌等。例如纖維素酶可以加到洗滌劑中來去除含有污漬或者泥土的纖維素。通常洗滌劑中還包括其它酶組分如淀粉酶和脂肪酶等。

纖維素酶還可以用于紙漿加工，如紙漿漂白、脫墨、纖維改性等以減輕傳統的酸堿處理造成的廢水污染。纖維素酶通過與纖維素作用輔助氧氣或者超氧化物對紙漿進行漂白以消除污染物氯對環境的危害。通常纖維素酶會與木聚糖酶組合實現助漂的功能。

纖維素的高溫酶解有很多的優勢，例如高溫下體系粘度的降低允許更多的投料量，高溫降低微生物污染的風險，與高溫預處理更加的協調，以及更快的水解速度。但是來源于里氏木霉的纖維素酶在高溫下的活性和穩定性都不好(Takashima,Iikura et al.1998,Lantz,Goedegebuur et al.2010)。而來源于細菌的高溫纖維素酶的表達量通常則非常底，經濟性較差。所以提高里氏木霉纖維素酶的穩定性是非常有必要的。

7家族糖苷水解酶占里氏木霉纖維素酶的比例大于65％，對于其穩定性的提高有重要應用價值。國際專利W02012/036810A2對里氏木霉內切酶Cel7B的熱穩定性進行突變體改造，該改造基于B-因子方法(Reetz,D Carballeira et al.2006)，即在柔性區域選擇突變位點，然后對這些位點進行突變篩選。發現如下一個或者多個突變體有更好的穩定性或者活性：G230K,G230A,G230E,G230Q,G230R,D113L,D113S,D115T,D115G。與野生酶相比3突變體G230A-D113S-D115T提高了T₅₀4℃，并在60℃下對微晶纖維素Avicel活性提高了2.5倍。

蛋白質穩定性的提高可以通過定向進化或理性設計來完成。理性設計通常采用的方法包括：提高蛋白質的核心堆積(Dahiyat and Mayo 1997)，去除埋藏的極性基團(Blaber,Lindstrom et al.1993,Hendsch,Jonsson et al.1996)，改變表面帶電基團分布(Makhatadze,Loladze et al.2003,Gribenko,Patel et al.2009,Schweiker and Makhatadze 2009)，引入二硫鍵(Robinson and Sauer 2000)等。每一種方法都有成功的例子。但由于穩定蛋白質折疊構象的相互作用非常復雜，通過理性設計提高蛋白質熱穩定性仍然是一個非常有挑戰性的科學問題。而新方法的引入將為解決這一問題提供新的契機。