[發明專利]一種新型二維光散射靜態細胞儀方法及裝置

在審

• 申請號: 201510047187.5
• 申請日: 2015-01-29
• 公開（公告）號: CN104568857A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 蘇絢濤;譙旭;解琳艷
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N21/63
• 分類號: G01N21/63;G01N21/41;G01B11/08
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及生物技術、生物醫藥、醫療器械以及環境與安全等領域。具體說來，本發明利用免標記、免微流控的一種易普及、高性能的二維光散射靜態細胞儀實現對單細胞或者微粒的高精度分析，預期在生物醫藥以及環境與安全等領域有重要應用。

背景技術

眾所周知，光學顯微鏡在細胞以及微粒分析方面具有廣泛應用。對于常規光學顯微鏡，其放大倍數主要取決于所配置的物鏡。一般說來，物鏡可放大4，10，20，40，60以及100倍，而要實現高分辨率測量，比如亞微米以及納米尺度測量，通常需要使用較大倍數的光學物鏡，但較大的放大倍數又會限制該物鏡相應的工作距離以及視場面積，造成聚焦操作以及樣本觀測等方面的局限性。而且，由于光學衍射極限的限制，常規光學顯微鏡的最高分辨率約為300納米。近年研究開發的近場光學顯微鏡以及隨機光學重建顯微鏡，可實現數十納米精度的光學分辨率，但其與常規光學顯微鏡存在很大差別，且儀器價格昂貴、操作復雜，一定程度了限制了該類技術的推廣與應用。

流式細胞術利用激光光束激發處于流動狀態中的單列細胞或微粒，然后對其散射光或熒光進行探測，可實現單細胞或微粒的逐個、多參數、快速定性以及定量分析。已知散射光不依賴于細胞樣品的制備技術，可反映細胞的物理參數；前向小角度的光散射信號(forward scatter,FSC)能夠反映細胞體積的大小，而側向90°方向的光散射信號(side scatter,SSC)對細胞膜、胞質、核膜的折射率更敏感，反映了細胞內精細結構和顆粒性質的信息。流式細胞儀主要由四大模塊組成：流動室與液流系統、光源與光學系統、信號收集與信號轉換系統、計算機與分析系統；具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統。細胞儀操作過程中，需將待測細胞經特殊染料進行熒光染色并制成細胞懸液，之后在液流壓力的作用下從樣品管射出，同時鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周，從而使細胞懸液在鞘液流的包裹下形成單行排列，且依次通過流動室的檢測區域。另外，以激光作為激發光源，使其垂直照射在檢測區域的樣品流上，當攜帶熒光素的細胞與激光正交時，就產生了散射光和激發熒光，它們同時被前向探測器和側向90°方向的探測器接收。這些光信號轉化成電信號，由放大器放大后，被傳送到計算機，經A/D轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件，然后進行相應的數據處理和分析，最終達到對細胞分類識別的目的。

若要完成細胞分選，需事先選定某個參數，用于判斷該細胞是否被分選:由噴嘴射出的液柱在壓電晶體幾十千赫茲的電信號作用下發生振動而均勻斷裂，形成了一連串的小水滴，根據選定的參數由邏輯電路判斷是否將被分選，而后由充電電路對選定的細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，從而落入不同的收集容器中，完成細胞的分選。

以上方法與裝置的問題在于：

(1)由于衍射極限的限制，傳統的光學顯微鏡用于細胞及微粒分析時的最高分辨率約在300nm，而此時其對物鏡的數值孔徑有較高的要求，如需使用100倍的油浸式物鏡；

(2)傳統的細胞分析裝置如流式細胞儀，通過前向散射光信息來分析細胞尺寸，但存在其分析精度低、不能明確的識別細胞尺寸的問題；

(3)由于流式細胞儀的激發光路是固定的，一般與細胞懸液的軸心正交，這就要求細胞必須在流經激光聚焦區時不能偏離其軸心，且不能聚集成團、阻塞管路，否則光束無法準確照射細胞中心，造成信號不穩定，影響測量結果的準確性。這需要復雜、昂貴的流體控制技術，如水動力聚焦技術，不太適用于大部分的實驗室；

(4)使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度都會影響細胞分析和分選效果，并且從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，延遲時間的精確測定也是影響分選質量的關鍵，這造成了流式細胞儀操作使用的復雜性；

(5)傳統掃描流式細胞儀只測量方位角一維光散射，由于存在細胞形狀任意性和細胞軸向問題，在固定角度得到的一維散射光譜會丟失很多信息；

(6)流式細胞儀檢測需要對被測細胞進行特殊染料的熒光染色或標記，這些標記會對細胞產生一定的損傷，影響細胞活性；

(7)傳統流式細胞儀的電磁場細胞分選對生物活體會產生一定影響。