[發明專利]一種識別凋亡細胞的熒光分子探針制備方法

有效

• 申請號: 201510045452.6
• 申請日: 2015-01-28
• 公開（公告）號: CN104629752A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 柳東芳;錢成;滕皋軍
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;A61K49/00
• 代理公司: 江蘇永衡昭輝律師事務所 32250
• 代理人: 王斌

技術領域

本發明涉及靶向細胞凋亡的小分子熒光探針的制備技術。

背景技術

細胞凋亡是指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是機體維持細胞群體數量穩定的重要方式。細胞凋亡異常是多種疾病的重要發病機制，因此對細胞凋亡進行實時無創的檢測對于很多疾病的臨床診斷和基礎研究均具有重要的意義。細胞凋亡會伴有細胞內的磷脂酰絲氨酸的外翻，使細胞膜具有負電性的磷脂表面。

迄今為止，檢測凋亡的方法手段有很多。從病理學角度來看，細胞質以及細胞核的皺縮、DNA的裂解、凋亡小體的形成等，這些都是凋亡標志性病理學特征。然而，這些特征標志僅能通過病理組織切片染色來加以驗證，這大大阻礙了凋亡檢測在臨床中的應用。

近年來，分子影像學的異軍崛起，為疾病診斷提供了更加豐富的信息，大大提高了疾病在體檢測的靈敏度和特異度。而就凋亡的分子影像而言，也有很多相應的分子探針，諸如針對凋亡細胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸的Annexin?V、針對凋亡細胞Caspase酶活化的一些智能響應探針等，這些分子探針在一定程度上能夠反應細胞凋亡。然而一方面，這些探針大部分僅能聚集于細胞膜上，并不能進入細胞內，這樣大大減小了探針的對比信噪比；另一方面，這些分子探針的分子量都相對較大，很大程度上影響了其在體內的生物分布，導致其在血液中的分子穩定性也較差，并且探針在血池中的清除率也相對較慢，同時這些大分子的分子探針也加大了合成的難度。而小分子量的分子探針卻能夠很好地規避上述缺點，更適用于臨床轉化。因此我們針對凋亡細胞外翻的磷脂酰絲氨酸，設計了一類小分子凋亡探針。這類分子中具有胱氨酸結構,其兩個羧基通過質子化作用，能夠選擇性的進入到具有負電性磷脂表面的凋亡細胞內，從而實現對凋亡細胞的識別。不僅如此，該探針可通過質子化作用，進入到細胞胞質內，極大的提高了探針對比信噪比。同時該方法具有簡單易行，制備的探針靈敏度高的特點，通過商品化的藥品，可以實現一步法制備。通過改變不同的熒光分子類型，可以得到應用于不同的生物環境的熒光探針。

發明內容

技術問題：本發明的目的是提供一種簡單易行的方法，制備識別凋亡細胞的熒光分子探針。

技術方案：為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：一種靶向細胞凋亡的熒光分子探針制備方法，步驟如下：胱氨酸分子和熒光分子溶液混合，恒溫振蕩器上反應3小時，制備得到檢測細胞凋亡的熒光分子探針(效果圖見附圖)。

優選的：1)?為保證胱氨酸上兩個氨基均與熒光分子反應，加入的熒光分子的量是胱氨酸物質的量的2.2-3倍；

2）熒光分子可以是FITC、?Cy5.5-NHS和NIR797；

3)?反應溫度為室溫，即25攝氏度；

有益效果：我們針對凋亡細胞外翻的磷脂酰絲氨酸，設計了一類小分子凋亡探針。這類分子中具有胱氨酸結構,其兩個羧基通過質子化作用，能夠選擇性的進入到具有負電性磷脂表面的凋亡細胞內，從而實現對凋亡細胞的識別。不僅如此，該探針可通過質子化作用，進入到細胞胞質內，極大的提高了探針對比信噪比。同時該方法具有簡單易行，制備的探針靈敏度高的特點，通過商品化的藥品，可以實現一步法制備。通過改變不同的熒光分子類型，可以得到應用于不同的生物環境的熒光探針。

附圖說明

圖?1、熒光分子探針合成路線示意圖；

圖2、可見光熒光分子探針靶向小鼠腦卒中模型病灶中凋亡細胞與Annexin?V共染效果圖

具體實施方式。

本發明的目的是提供一種簡單易行的方法制備一種能夠識別凋亡細胞的熒光分子探針。該熒光分子探針利用商品化的化學藥品，只需要一步反應即可制備，且易于純化。

實施例1

1)???可見光熒光分子探針的制備：稱取4?mmol胱氨酸溶于600微升碳酸鈉水溶液中，稱取?8.9?mmol的FITC溶于100微升的二甲基亞砜中。

2)???將兩溶液混勻，25攝氏度下振蕩3小時。

3)???得到的混合物放入截留分子量為1000的再生纖維素纖維材質的透析袋中在純水中透析6小時，中間換2次水。

4)???所得溶液凍干，即得到可見光熒光分子探針。

實施例2

1)???近紅外熒光分子探針的制備：稱取?4mmol胱氨酸溶于600微升碳酸鈉水溶液中，稱取?9?mmolCy5.5-NHS溶于100微升的二甲基亞砜中。

2)???將兩溶液混勻，25攝氏度下振蕩3小時。