[發明專利]一種稗草組織培養成苗的方法

有效

• 申請號: 201510043133.1
• 申請日: 2015-01-28
• 公開（公告）號: CN104620983A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 李崗;吳長興;徐明飛;徐筆奇;蒼濤;陳麗萍;蔡磊明
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州金道專利代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種稗草組織培養成苗的方法。

(二)背景技術

稗草(Echinochloacrus-galli)是世界性的農田惡性雜草，主要通過化學農藥防治。由于連續多年使用單一除草劑，稗草已經對10類不同作用機理的除草劑產生了抗藥性(Heap,2015)。抗性稗草引起農藥的用量增加、殘留和污染等問題，嚴重制約農業可持續發展，成為是農業生產的難題。研究稗草的抗藥性機理是解決抗藥性問題的重要途徑，其中稗草轉基因是驗證抗藥基因功能的主要技術，但是目前缺少獲得高效稗草受體系統的方法。建立稗草基因轉化受體系統是實現外源基因轉化的先決條件，而高效受體系統的獲得依賴稗草組織培養技術。

目前有關稗草組織培養的文獻還比較少。檢索Springer，ScienceDirect，Wiley?online?library，ProQ?uest等主要外文數據庫。其中1984年Wang?da?yuan等首次通過稗草花序作為外殖體在含有2,4-D和6-BA的MS培養基上獲得白色、緊密的胚狀體，并通過調節2,4-D的含量繼續培養獲得了稗草的再生苗。這種方法不經過組織培養階段，而是直接由外殖體得到胚狀體進而發育成苗，至少需要半年時間，具有試驗難度高，不易大規模培養，時間長，重復性差等特點。

(三)發明內容

為解決現有技術中以稗草花序作為外殖體得到胚狀體進而發育成苗試驗難度高、時間長、重復性差，不宜大規模培養的不足，本發明以稗草成熟胚作為外殖體通過種子處理，愈傷誘導，芽分化、生根培養和激素的選擇等研究，探索通過組織培養獲得稗草再生苗的方法，建立稗草基因轉化過程中的植物受體系統，為稗草組織培養和轉基因研究提供基礎信息。

本發明采用的技術方案是：

一種稗草組織培養成苗的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)種子處理：選取常規對二氯喹啉酸敏感的稗草種子(如Echinochloa?crusgalli、Echinochloa?crusgalli?var.zelayensis、Echinochloa?crusgalli?var.mitis等)，去除種皮與一半胚乳，將帶胚乳的半粒種子在室溫下用滅菌水浸泡3～4小時后，著用60～70％乙醇浸泡30～60秒，再用無菌水沖洗2～3次，接著用0.05～0.1％(m/v，1％表示100mL溶液含有1g溶質)的升汞邊振蕩邊消毒10～15分鐘，接著再用無菌水沖洗4～5次，最后一次浸泡20～30分鐘，再用無菌水邊振蕩邊清洗1次，然后在超凈臺上將種子置于無菌濾紙上10～15min；

(2)愈傷誘導培養：將處理后的種子放在愈傷組織誘導培養基上，在28～30℃黑暗培養6～8天；所述愈傷組織誘導培養基組成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L瓊脂，1.0～2.0mg/L2,4-D，0.2～0.3mg/L?6-BA，0.1～0.2mg/L?NAA，溶劑為MS培養基；

(3)繼代培養：挑選白色、緊實、未污染的愈傷轉移到繼代培養基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小時、黑暗8小時條件下，培養5～8天；所述繼代培養基組成如下：0.2～0.3mmol/L甘露醇，3～5％蔗糖，8～10g/L瓊脂，0.5～0.8mg/L?2,4-D，0.5～0.8mg/L6-BA，溶劑為MS培養基；

(4)愈傷分化培養：挑選緊實、未污染的愈傷轉移到分化培養基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小時、黑暗8小時條件下，培養10～14天；所述分化培養基組成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L瓊脂，0.2～0.4mg/L?ZT，1.0～2.0mg/L?NAA，溶劑為MS培養基；

(5)生根培養及移栽：挑選已經生芽、未污染的愈傷轉移到生根培養基上，在28～30℃16小時光照、黑暗8小時、3000～4000lx光強條件下，培養7～8天，待根長出后，用自來水澆灌3天，然后移栽土壤；所述生根培養基組成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L瓊脂，溶劑為1/2MS培養基。

植物組織培養的原理是利用細胞的全能性，將離體的體細胞或單倍體細胞誘導成體細胞胚或胚狀體進而發育成完整的植株的過程，其中胚狀體具有很強的接受外源DNA的能力，是理想的基因轉化感受態細胞，本發明方法通過愈傷誘導等組織培養方法成功得到再生苗，為稗草的轉基因研究創造了很好的工具。