[發明專利]一種枯草芽孢桿菌GC5表面展示GCRVVP7蛋白的重組芽孢及制備方法

有效

• 申請號: 201510041532.4
• 申請日: 2015-01-27
• 公開（公告）號: CN104560860B
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 張永安;陳丹丹;郭霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/46;C12R1/125
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種枯草芽孢桿菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重組芽孢，同時還涉及一種枯草芽孢桿菌GC5表面展示GCRV VP7蛋白的重組芽孢的制備方法。

背景技術

草魚（Ctenopharynodon idellus）作為我國四大家魚之一，是我國廣泛飼養的一種經濟魚類，具有重要的經濟價值。草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）是引起草魚出血病的主要病原之一，嚴重影響草魚養殖業的健康發展。由于不同地區病毒株間基因節段重配和抗原漂移，可將現已分離的GCRV毒株分為3型（I、Ⅱ、III型），其中Ⅱ型為目前主要流行株（曾偉偉等. 草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測方法的建立及其應用[J].中國水產科學，2013，20 (2)：419-426）。GCRV是無囊膜的雙鏈RNA病毒，VP7為該病毒的外衣殼蛋白，其功能主要與病毒侵染和進入細胞有關（Nibert M L, Schiff L A. Reoviruses and their replication. In: Knipe D M,Howley P M,eds. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2001. 1679-1728）。近年來，大量研究表明了利用VP7蛋白進行抗草魚出血病育種及疫苗研制的可行性，原核表達VP7蛋白具有良好的抗原性，能夠誘導產生中和抗體（Shao L, Sun X, Fang Q. Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viral infectivity [J]. Virol . 2011. j8:347）；VP7蛋白雙基因及團頭魴β-肌動蛋白啟動子的重組載體pFastBac-p-VP71-VP72構成的核酸疫苗，對草魚出血病具有較好的免疫效果（徐詩英，劉林，李蜻慧等. 草魚呼腸孤病毒VP7基因核酸疫苗的構建及免疫效果 [J]. 水產學報. 2011, 35 (11): 1694-1700)。然而，重組蛋白質亞單位疫苗的穩定性及耐受性差，容易被草魚消化道內的蛋白酶降解，而核酸疫苗的免疫方式及免疫劑量又嚴重限制了其免疫效果。因此，尋求一種新的方法來制備GCRV疫苗十分必要。

枯草芽孢桿菌是一種非致病性革蘭氏陽性菌，常被用于食品或飼料添加劑。在營養缺乏或其它脅迫（極端溫度、濕度等）條件下，能形成具有抗逆性的休眠體（芽孢）。芽孢由芽孢髓質、皮層、芽孢衣殼和芽孢外壁構成，芽孢衣殼主要由多種衣殼蛋白構成，如cotB、cotC、cotF、cotG 和cotX等，這些芽孢衣殼蛋白基因能夠與外源蛋白基因融合，同源重組轉化芽孢桿菌，在芽孢衣殼蛋白基因啟動子及調控基因的精密調控下，正確地將外源蛋白表達于芽孢表面（參考文獻3篇），且其芽孢能夠抵御胃腸道酸性消化液的破壞，最終能夠將抗原有效傳遞給后腸免疫細胞從而產生保護性抗體（Wang X Y, Chen W J, Tian Y L. Surface display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an oral vaccine candidate [J]. Vaccine. 2014. 1338-1345），因此，芽孢成為極端環境中運載外源抗原蛋白等生物大分子的潛在有效載體。

本發明所用的枯草芽孢桿菌GC5分離自草魚腸道，避免了其它來源的細菌所造成的免疫原性及安全性問題。利用草魚來源的野生型枯草芽孢桿菌表面展示Ⅱ型GCRV的外衣殼蛋白VP7，不僅突破了野生菌株難以轉化及轉化率低的瓶頸，而且為針對目前流行的草魚出血病口服疫苗提供了一種有效的制備方法。

發明內容