[發(fā)明專利]用于鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列及FISH鑒別方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510041271.6
• 申請(qǐng)日: 2015-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN104694627B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李宗蕓;俞立璇;韓永華;陳孚堯;孫健英;董婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務(wù)所32205
• 代理人: 華德明

1.用于鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列，其特征在于，序列1為SEQ NO：1所示的核苷酸序列，序列2為SEQ NO：2所示的核苷酸序列。

2.一種利用權(quán)利要求1所述DNA重復(fù)序列鑒別甘薯染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，質(zhì)粒DNA提取后，通過缺刻平移法，用生物素標(biāo)記的Itf_1和用地高辛標(biāo)記的Itf_2，形成核苷酸序列如SEQ NO：1所示的Itf_1探針和核苷酸序列如SEQ NO：2所示的Itf_2探針，用于對(duì)甘薯染色體的鑒別，具體步驟包括：

1)染色體片的制備

按常規(guī)植物材料培養(yǎng)，待植株根尖長(zhǎng)至0.5-1cm時(shí)，切下生長(zhǎng)旺盛的根尖，經(jīng)8-羥基喹啉在25℃下處理2h后，用卡諾氏固定液固定24h；去離子水沖洗浸泡30min，充分洗去固定液；用含2％纖維素酶和1％果膠酶的纖維素果膠酶在37℃酶解1-2h；去離子水沖洗浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干凈玻片上，用鑷子尖端敲碎根尖，懸空滴加卡諾氏固定液使其充分散開，酒精燈上烤一下，晾干；鏡檢，選擇分散良好的染色體片-20℃保存；

2)熒光原位雜交

①烤片：雜交之前，將制好的片子置于65℃烘箱中干燥30-60min；

②雜交液的配制：取ssDNA4μL和Itf_1，Itf_2探針DNA各3μL，混勻后于65℃烘箱中烘至4μL，再加入70％去離子甲酰胺10μL、50％硫酸葡聚糖4μL、20×SSC 2μL混勻，封口膜封好備用；

③變性液的配制：取雙蒸水20μL、20×SSC10μL、70％去離子甲酰胺70μL，混勻，封口膜封好備用；

④探針變性：取出烘箱中的染色體片，將烘箱升溫至85℃，將上述變性液加于取出的載玻片上，加上蓋玻片；85℃烘箱中變性2-4min；甩掉蓋玻片，立即依次浸入-20℃70％、95％、100％的冰乙醇中各5min；取出玻片，空氣中干燥30min以上；

⑤雜交：將雜交液放入沸水中變性10min，迅速置于冰上冷卻10min，加于上一步干燥后的載玻片上，蓋上蓋玻片，室溫5-10min；置于80-85℃烘箱中變性2min，放入培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17-21h；

⑥雜交后洗脫：取出培養(yǎng)箱中的玻片，置于2×SSC中脫色搖床上室溫洗脫2×5min；置于42℃2×SSC中洗脫10min；2×SSC中脫色搖床上再次洗脫5min；1×TNT中脫色搖床上洗脫5min，晾干；剪取和玻片大小吻合的封口膜，取出TNB室溫融化；避光條件下，取一個(gè)1.5μL的EP管，加入100μL TNB，1μL Bio，0.5μLDig抗體，混勻，取100μL加于晾干的玻片上，蓋上封口膜，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h；取出玻片，置于1×TNT中脫色搖床上洗脫3×5min；晾干玻片5-10min；

3)信號(hào)檢測(cè)

加13μL DAPI，蓋上蓋玻片，晾干，封片，置于熒光顯微鏡下，根據(jù)制片坐標(biāo)確定目標(biāo)染色體，對(duì)染色體進(jìn)行拍照，然后依次轉(zhuǎn)換濾光片，分別對(duì)兩個(gè)探針的雜交信號(hào)進(jìn)行拍照；

4)二次雜交

①洗片：揭掉第一次雜交的蓋玻片，將載玻片置于2×SSC溶液中脫色搖床上洗脫2×5min；置于2×SSC溶液中脫色搖床上再次洗脫2×10min；然后依次浸入70％、95％、100％的乙醇中脫色搖床上室溫洗脫各5min；置于卡諾氏固定液中固定5min，取出玻片，晾干，充分曝光2-3天；

②熒光原位雜交：用45S，5S rDNA探針進(jìn)行第二次熒光原位雜交，雜交過程同步驟2，再分別對(duì)兩個(gè)探針的雜交信號(hào)進(jìn)行拍照；采用成像系統(tǒng)分析軟件將染色體和雜交信號(hào)進(jìn)行圖像合成，用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)整。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別甘薯染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述Itf_1探針是這樣獲得的：根據(jù)SEQ NO：1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增待測(cè)模板，所述引物為，上游引物：5’-TTCCCGATGCGTGGAGTT-3’，下游引物：5’-CTCCATTGCGGTTGTCTTA-3’，采用PCR法合成生物素標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ NO：1所示的探針，得到Itf_1探針；

所述Itf_2探針是這樣獲得的：根據(jù)SEQ NO：2所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增待測(cè)模板，所述引物為，上游引物：5’-CCCCACCTTCAACCAACT-3’，下游引物：5’-GCAGCGGTTAGGAGGTGA-3’，采用PCR法合成地高辛標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ NO：2所示的探針，得到Itf_2探針。