[發(fā)明專利]一種魚精蛋白專用編碼基因及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510037158.0
• 申請日: 2015-01-26
• 公開（公告）號: CN104711264A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李招發(fā);占申標(biāo);張雪;曾雨漢;沈丹;馬婧文;林榮杰;刁勇;許瑞安
• 申請（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/46
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 陳智海

1.一種魚精蛋白專用編碼基因，其特征在于：該編碼基因的堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.一種利用權(quán)利要求1所述編碼基因制備魚精蛋白的方法，其特征在于：該方法包括如下具體操作：

(1)將權(quán)利要求1所述編碼基因與載體pET22b連接后轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)，獲得工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro；

(2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro單菌落并接種入含Amp100μg/ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，之后按1:100的體積比轉(zhuǎn)入含Amp100μg/ml的乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)20h，接著于4℃、6000rpm條件下離心20min，然后收集菌體，并置于-80℃下保存；

(3)將步驟(2)收集到的菌體經(jīng)-80℃和4℃反復(fù)凍融三次裂解菌體，加入破菌液，且每1克菌體加入10毫升破菌液，并于4℃，10000rpm下離心20min，離心結(jié)束后分別收集沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接著采用洗滌液洗滌沉淀兩次，之后用溶解液溶解洗滌后的沉淀，得溶解液；將溶解液經(jīng)Ni?Sepharose親和層析進(jìn)行純化洗脫，所用洗脫液的組分為0.5M?NaCl、20mM?NaH₂PO₄、500mM?Imidazole、8M?Urea、pH＝7.4，最終洗脫液中的蛋白即為純化后的融合蛋白CYGB-Pro；

(4)將步驟(3)所得純化后的融合蛋白CYGB-Pro進(jìn)行CNBr裂解，具體地：將純化后的融合蛋白CYGB-Pro，置于通風(fēng)櫥中操作，加入終濃度為0.2M的濃鹽酸、終濃度為50mg/ml的CNBr，避光、室溫裂解24h，之后加入等體積的ddH₂O滅活CNBr；然后采用流速為3mL/min的G-25分子篩進(jìn)行脫鹽純化，即得所述魚精蛋白，且脫鹽純化采用的平衡液和洗脫液均為去離子水。

3.根據(jù)權(quán)利要求2一種編碼基因制備魚精蛋白的方法，其特征在于：所述破菌液的組分：0.5M?NaCl，20mM?NaH₂PO₄，1mM?EDTA，0.5％Triton?X-100，pH?7.4；洗滌液的組分：0.5M?NaCl，20mM?NaH₂PO₄，2M?Urea，0.5％TritonX-100，1mM?EDTA，pH?7.4；溶解液的組分：0.5M?NaCl，20mM?NaH₂PO₄，50mM?Imidazole，8M?Urea，1mM?DTT.pH＝7.4。

4.根據(jù)權(quán)利要求2一種編碼基因制備魚精蛋白的方法，其特征在于：所述Ni?Sepharose親和層析的條件中為：Binding?Buffer為0.5M?NaCl，20mMNaH₂PO₄，50mM?Imidazole，8M?Urea.pH＝7.4；Elution?buffer為0.5M?NaCl，20mM?NaH₂PO₄，500mM?Imidazole，8M?Urea.pH＝7.4。

5.根據(jù)權(quán)利要求2一種編碼基因制備魚精蛋白的方法，其特征在于：所述LB培養(yǎng)基：10g/L?Tryptone，5g/L?Yeast?Extarct，10g/L?NaCI；乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：15g/L?Tryptone，12g/L?Yeast?Extarct，3g/L?NaH₂PO₄·2H₂O，7g/LK₂HPO₄·3H₂O，2.5g/L?NaCI，0.2％葡萄糖，2.1mM乳糖，0.05％MgSO₄·7H₂O。