[發明專利]用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒

有效

• 申請號: 201510035254.1
• 申請日: 2015-01-24
• 公開（公告）號: CN104651531B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 鄭海學;曹偉軍;朱紫祥;郭建宏;楊帆;靳野;李丹;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司62102
• 代理人: 張晉

技術領域

?本發明涉及一種病毒TapMan熒光定量檢測試劑盒，確切講是一種用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型一步法TapMan?熒光定量PCR檢測試劑盒。

背景技術

青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀瘤（juvenile-onset?recurrent?respiratory?papilloma,JO-RRP）特指發生于上下呼吸道的乳頭瘤病，是一種由乳頭瘤狀病毒（human?papillomavirus,HPV）病毒引起的具有高度復發性及侵襲性的疾病，可以發生于呼吸道任何部位，其中最易累積與鱗狀上皮與纖毛柱狀上皮交界處。JORRP患者首發癥狀主要是聲音嘶啞，首發年齡最小為兩周，最大為14周歲，且病程表現多樣，個別患兒可以自發緩解，多數則呈現侵潤生長并需要多次手術甚至出現喉、氣管狹窄梗阻窒息死亡，臨床治療十分棘手。

HPV屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是由8000個堿基組成的環狀雙鏈DNA病毒，約有200余中亞型。根據病毒的基因組結構、生物學特性和致病性，可分為五大類，即α、β、γ、μ和ν，低危型的HPV6和HPV11屬于α乳頭瘤病毒。低危型與青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀瘤密切相關，國內外學者即已開展了相關的治療研究，然而尚未建立有效的細胞培養模型或簡便的病毒繁殖模型，難以進行傳統的滅活疫苗或著監督疫苗的研制。

研究認為HPV的亞型與病情嚴重程度和臨床經過相關，而且亞型之間存在毒力差異，因此臨床上能夠快速區分引起青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPV11亞型顯得的尤為重要。常規PCR方法檢測靈敏度不高，且易出現假陽性，已有的檢測性病HPV11亞型的SYBR?Green熒光法屬于非飽和染料，不能完全飽和的嵌入DNA雙鏈中，會造成檢測結果的不準確。

發明內容

本發明提供一種對可用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型的高度特異性引物對及探針，以及包括有這一高度特異性引物對及探針的可特異、敏感、快速和便捷的用于定量檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型的試劑盒。

本發明的用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒的高度特異性引物對，其序列分別為SEQ?ID?No.1和?SEQ?ID?No.2。

本發明的用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒內包括的高度特異序列為?SEQ?ID?No.3的探針。為使用方便，本發明的試劑盒內還有2×One?Step?RT-PCR?BufferⅢ、TaKaRa?Ex?Taq?HS(5U/μL)和PrimeScript?RT?Enzyme?MixⅡ等擴增所需要的所有實驗試劑，檢測時只需按照說明加入檢測樣品即可。

本發明的用于檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒的試劑盒內還含有作為陰性對照的不含青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型的DNA樣品和作為陽性對照的含有青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型的DNA樣品。

前述本發明的引物對優選擴增條件為：?95℃?10sec，1個循環→95℃?10sec，55℃?30sec，72℃?30sec，40個循環。

本發明的試劑盒實際上是一種一步法TapMan?熒光定量PCR檢測的試劑盒。一步法TapMan?熒光定量PCR檢測是使用5`端帶有熒光物質，3`端帶有淬滅物質的TapMan探針進行熒光檢測，當探針完整時，5`端熒光物質受到3`端淬滅物質的制約，不能發出熒光。而當TapMan探針被分解后，5`端的熒光物質便會游離出來，發出熒光。在PCR反應中特異性探針和模板雜交，延伸是聚合酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質發出熒光。通過檢測反應體系中的熒光強度，從而可以達到檢測PCR產物擴增量的目的。在PCR使用本試劑盒進行Real?Time?PCR反應可在同一反應管內連續進行，操作簡單，并能有效防止污染。

利用本發明試劑盒進行青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型一步法TapMan熒光定量PCR檢測，其優點在于，根據青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型流行株的L1基因保守涉及到兩條高度特異性引物和探針，在該病毒DNA提取的基礎上，對組織樣品進行熒光定量PCR擴增，實現對青少年復發性呼吸道乳頭瘤HPV11亞型的定量檢測。

本發明用到的TaqMan探針法為針對青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPV11亞型特異的核苷酸序列設計的探針，探針與模板是高度特異性結合，特異性和敏感性均高。填補了臨床上快速分型檢測青少年復發性呼吸道乳頭瘤狀病毒HPV11亞型的空白。