[發(fā)明專利]用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510033736.3
• 申請(qǐng)日: 2015-01-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104655616A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李溫柔;郭智勇;張寧;陳貝貝;沙玉紅;武琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

1.一種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）多功能氧化石墨烯材料的合成

a.?磁性氧化石墨烯的合成：在潔凈的三頸燒瓶中加入30～50?mL?1?mg/mL的氧化石墨烯，超聲1?h；然后在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下加入20～30?mL?0.05～0.07?mol/L的氯化亞鐵溶液和20～30?mL?0.10～0.15?mol/L的氯化高鐵溶液，于70～90℃攪拌回流，同時(shí)緩慢滴加10～15?mL?20%～30%的氨水至溶液的pH?=?10～11，回流處理3～5?h；冷卻后，用二次水洗滌至溶液的pH?=?7，定容到50?mL，即得磁性氧化石墨烯材料溶液，4?℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

b.?取步驟（a）中所得的磁性氧化石墨烯材料溶液200?μL于玻璃瓶中，超聲1?h，然后加入200～400?μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，同時(shí)滴加稀鹽酸溶液至溶液pH?=?4～6，振蕩孵育1?h，二次水洗滌3次；再加入30～50?μL?0.001～0.1?mol/L的電化學(xué)發(fā)光體溶液和30～50?μL?10～20?μmol/L的適配體溶液，混合均勻，然后滴加氫氧化鈉溶液至溶液pH?=?8～10，振蕩孵育4?h，二次水洗滌3次后；加入質(zhì)量百分濃度為1～2%的牛血清白蛋白溶液100～200?μL，4℃下浸泡1?h，二次水洗滌3次，定容至200?μL，即可得到適配體和電化學(xué)發(fā)光體同時(shí)標(biāo)記的多功能化氧化石墨烯材料溶液，4?℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

（2）電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的組裝

將直徑為3～5?mm的磁性玻碳電極依次用1.0?μm、0.3?μm和0.05?μm的三氧化二鋁漿拋光打磨，然后在乙醇和二次水中分別超聲2?min，氮?dú)獯蹈?；?～10?μL步驟（1）中制備的多功能化氧化石墨烯材料溶液，滴涂到上述預(yù)處理過(guò)的磁性玻碳電極表面，多功能化氧化石墨烯材料即被均勻、牢固地吸附到電極表面，即得電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法，其特征在于：所述的電化學(xué)發(fā)光體溶液中溶質(zhì)為魯米諾或N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾，溶劑為0.1mol/L氫氧化鈉溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法，其特征在于：所述的偶聯(lián)試劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺溶于水中得到，所述的偶聯(lián)試劑中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度為10～100?mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺摩爾濃度為1～10?mmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法，其特征在于：所述的適配體為氨基修飾的DNA片段，堿基序列為：5′-NH₂-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′。

5.一種利用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的方法，其特征在于具體步驟如下：

將權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)制備的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器浸泡在不同濃度的腫瘤標(biāo)志物MUC1溶液中，37℃下溫育1?h，然后使用二次水輕輕洗滌后作為工作電極；使用鉑絲電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系；將三電極體系置于緩沖溶液中，啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)，測(cè)量體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值；獲得一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物MUC1溶液對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物MUC1濃度之間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系可以檢測(cè)待測(cè)樣品中腫瘤標(biāo)志物MUC1的濃度。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的方法，其特征在于：所述的緩沖溶液為含有1～3?mmol/L?H₂O₂的0.05?mol/L?pH?=?9～11?的Na₂CO₃-NaHCO₃體系緩沖溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MUC1的方法，其特征在于電化學(xué)反應(yīng)的條件如下：電位階躍計(jì)時(shí)電流法；脈沖寬度：0.25秒；脈沖間隔：30秒；初始電壓：0?V；脈沖電壓：1?V。