[發明專利]一種減輕植物組培外植體污染的方法

有效

• 申請號: 201510033462.8
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104521762B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 劉福平
• 申請（專利權）人: 福建省亞熱帶植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬農林領域的植物組織培養技術，具體涉及降低植物組培外植體培養污染率的方法。

背景技術

植物組織培養技術種苗生產、脫除病毒、種質改良等具有廣闊的市場前景。目前植物組織培養技術環節中，外植體污染的防治是組織培養成功的主要難點。外植體所攜帶微生物包括表面雜菌和內生菌，表面雜菌主要是真菌和細菌，通過短時間的浸泡消毒比較容易清除，首選的外植體消毒方法都是浸泡法，先用70%酒精浸泡10-30s，0.1%氯化汞浸8-12min或用2%次氯酸鈉（飽和次氯酸鈣溶液）浸泡15-20?min，氯化汞對人毒性極強，對環境危害大，次氯酸鹽消毒效果也不盡人意。內生菌存在于組織內部，主要是細菌，液體消毒劑短時間不易滲入殺滅，而內生菌潛伏期長（5天以上），造成培養期間大面積污染，雖然有在培養基添加抗生素，但抗生素殺菌范圍窄，微生物易產生抗藥性。總之，外植體除菌目前仍沒理想的方法，外植體污染的防治是組織培養成功的主要難點。

目前已經公告的專利，一些外植體消毒劑專利仍使用氯化汞或次氯酸鈉，如公布號?101933459A?、1628507A、?102499077A、101138317?A、102326514?A、102349438A、102577975A、?101946809?A，不含汞或次氯酸鈉（鈣）的外植體消毒劑專利有公布號?101632392、?101461329、?102742506A，上述專利均采用浸泡消毒法。將殺菌劑加入培養基抑菌的專利有公布號:?101946809A和?101138317。公布號103283604A采用無菌去離子水浸泡百合外植體，可以使外植體表層細胞破裂，內生菌溢出，再浸泡消毒除菌。

發明內容

本發明以衣膜（混合殺菌劑）包囊整個組培外植體再接種到培養基培養，衣膜透水透氣，對植物細胞沒明顯傷害，培養基營養及激素能被外植體吸收，細胞呼吸不受影響。與常規的外植體消毒相比，具時間上和空間上的優勢，（1）與常規的短時間浸泡消毒不同，本發明衣膜包囊整個外植體接種，殺菌劑有較長時間（整個培養期間）作用于外植體表面抑殺雜菌，也有足夠時間滲入組織殺滅內生菌。（2）抑制外植體污染也經常在培養基添加抗菌劑，該方法只有與培養基接觸的外植體部分，抗菌劑才起抑殺作用，本發明衣膜包囊整個外植體，防止雜菌繁殖擴散到培養基，尤其是衣膜封堵了外植體切面，防止內生菌繁殖擴散到培養基造成污染。由于本發明殺菌劑應用上具時間上和空間上的優勢，衣膜劑可含較低的殺菌劑使用劑量，對植物組織傷害小，還可選用低毒環保的殺菌劑。

本發明提供的技術方案如下：

一種含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體方法，其特征在于，衣膜劑透氣、透水，透光性好，不與培養基成分發生反應，對植物細胞傷害小。成膜劑采用海藻酸鈉，衣膜劑的營養成分、激素、酸堿度與培養基的營養成分、激素、酸堿度一致，殺菌劑在衣膜劑酸堿度下具殺菌能力。

所述的成膜劑海藻酸鈉濃度2%-5%，海藻酸鈉交聯固化劑為2%氯化鈣溶液。殺菌劑一種或幾種組合，在衣膜劑中的濃度分別為：抗生素0.005%-0.03%、3-羥基-5-甲基異惡唑（惡霉靈）0.02-0.2%、3-（二甲氨基）丙基氨基甲酸丙酯鹽酸鹽（霜霉威鹽酸鹽）0.1-0.5%、三乙磷酸鋁0.1-0.5%、甲酚磺酸0.05-0.5%、異噻唑啉酮0.05-0.5%、十二烷基二甲基芐基溴化銨（新潔爾滅）0.02-0.2%、重氮烷基咪唑脲（極美-Ⅱ）0.1-0.5%、亞硫酸氫鈉0.1-0.5%、六亞甲基四胺（烏洛托品）0.1-0.5%。

海藻酸鈉衣膜劑配制方法：海藻酸鈉先用少量水溶化，附加的營養成分、植物激素與培養基成分相同，能耐高壓滅菌的成分（包括殺菌劑）按常規方法配成水溶液，與海藻酸鈉混合，定容，調pH與培養基相同，高壓滅菌，得粘稠液冷卻待用。不耐高壓滅菌的營養成分、植物激素、殺菌劑混合液過濾除菌，加入已經高壓滅菌的海藻酸鈉，攪拌混勻待用。氯化鈣單獨高壓滅菌。接種時將已經消毒的外植體泡入含附加成分的海藻酸鈉衣膜劑，取出輕輕抖掉多余衣膜劑粘稠液，粘有衣膜劑的外植體投入氯化鈣溶液，固化數分鐘，取出投入無菌水洗去多余氯化鈣，在無菌濾紙上吸去無菌水，接種在培養基表面，輕壓外植體使其稍陷入培養基瓊脂塊。