[發(fā)明專利]一種蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1及其重組表達(dá)載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510033347.0
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104673810B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張琦;劉小嶺;楊曉霞;魏云林;林連兵;季秀玲
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1及其重組表達(dá)載體，具體涉及以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體后誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化后得到純酶，并對該酶進(jìn)行了酶活測定及酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蘋果酸脫氫酶( MDH)廣泛分布于生物體內(nèi)，是一種活性非常強(qiáng)的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關(guān)。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環(huán)、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進(jìn)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細(xì)胞內(nèi)定位的不同其表達(dá)種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，擔(dān)負(fù)著將NADH轉(zhuǎn)入線粒體的重任，并且還對調(diào)控三羧酸循環(huán)有作用，同時cMDH還是核酸通路(NACh)復(fù)合體的一個組成部分。

蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強(qiáng)的酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細(xì)胞漿以及錐蟲甘油體內(nèi)。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫(yī)學(xué)方面也引起越來越多的關(guān)注如利用基因工程疫苗預(yù)防人體帶絳蟲病已是備受關(guān)注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學(xué)分析，預(yù)測到胞漿型MDH是一個潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC（彌散性血管內(nèi)凝血），心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領(lǐng)域，蘋果酸脫氫酶用于有機(jī)酸含量的測定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質(zhì)的測定，應(yīng)用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶。總之，MDHs作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，國內(nèi)外對其己進(jìn)行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應(yīng)用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個體發(fā)育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結(jié)構(gòu)及功能、催化機(jī)制，對于酶重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機(jī)制有著重要的意義。同時MDH的應(yīng)用研究也將會推動MDHs轉(zhuǎn)基因植物及手性藥物的進(jìn)一步發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從深黃被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中分離的蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1，該基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO：1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長為990bp（堿基），該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其片段。

本發(fā)明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO：1所示基因直接與不同表達(dá)載體（質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體）連接所構(gòu)建的重組載體。

本發(fā)明另一目的是提供一種含有該蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1的重組表達(dá)載體或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21。

用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，用CaCl₂、電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。

本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)商業(yè)化蘋果酸脫氫酶等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優(yōu)點(diǎn)，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22蘋果酸脫氫酶基因MIMDH1構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aMIMDH1質(zhì)粒圖譜；