[發明專利]一種檢測平頭炭疽菌的環介導等溫擴增引物組合物及其應用

有效

• 申請號: 201510031690.1
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104593502B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 鄭小波;田擎;陸辰晨;王帥帥;張海峰;王源超
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

1.SEQ?ID?NO.1所示的Rpb1基因序列作為檢測靶標在檢測平頭炭疽菌中的應用。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于SEQ?ID?NO.1所示的Rpb1基因序列作為檢測靶標在LAMP檢測平頭炭疽菌中的應用。

3.一種用于LAMP檢測平頭炭疽菌的引物組合物，其特征在于由SEQ?ID?NO.2所示的正向外引物Rpb1-F3，SEQ?ID?NO.3所示的反向外引物Rpb1-B3，SEQ?ID?NO.4所示的正向內引物Rpb1-FIP，SEQ?ID?NO.5所示的反向內引物Rpb1-BIP，SEQ?ID?NO.6所示的環引物Rpb1-LF組成。

4.權利要求3所述的引物組合物在檢測平頭炭疽菌中的應用。

5.權利要求3所述的引物組合物在制備平頭炭疽菌檢測試劑中的應用。

6.一種用于檢測平頭炭疽菌的LAMP試劑盒，其特征在于包含權利要求3所述的引物組合物。

7.根據權利要求6所述的LAMP試劑盒，其特征在于包含檢測溶液，每毫升所述的檢測溶液通過以下方法制備得到：0.8μM正向內引物Rpb1-FIP、0.8μM反向內引物Rpb1-BIP、0.1μM正向外引物Rpb1-F3、0.1μM反向外引物Rpb1-B3、0.1μM環引物Rpb1-LF、1.4mMdNTPs、8mMMgSO₄、0.8M甜菜堿、0.8M?Tris-HCl(pH8.8)、0.4mM?KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、4％Triton?X-100、8U·μL^-1Bst?DNA?polymerase，加入超純水制備成1mL檢測溶液。

8.根據權利要求6或7所述的LAMP試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還含有染料SYBR?Green?I。

9.一種LAMP檢測平頭炭疽菌的方法，其特征在于包括取18μL權利要求7所述的檢測溶液，3μL滅菌去離子水，加入4μL待檢DNA溶液，總體積為25μL進行LAMP反應；反應程序為：62℃，70min；擴增后加入染料SYBR?Green?I作為反應指示劑，肉眼觀察，以SYBR?Green?I的顏色變化和熒光強弱做為結果判定標準：在常光下，黃綠色表示檢測為陽性，即有平頭炭疽菌存在，橙色表示檢測結果為陰性，即不含有平頭炭疽菌，或所含平頭炭疽菌未達檢測限。