[發(fā)明專利]一種檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510031461.X | 申請日： | 2015-01-22 |
| 公開（公告）號： | CN104745684A | 公開（公告）日： | 2015-07-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉波;王德朋;陸鑫;丁新春;侯翔宇;姚芳;周德超;李愛民;李睿華 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237 | 代理人： | 賀翔;楊文晰 |
| 地址： | 210093 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 檢測 污水 中亞 硝酸鹽 氧化 群落 結(jié)構(gòu) 方法 | ||
1.一種檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，其特征在于，具體步驟如下：
a)提取污水中活性污泥的全部基因組DNA；
b)以全部基因組DNA為模板，以上游引物序列SEQ?ID?No.1和下游引物序列SEQ?ID?No.2進行nxrA基因PCR擴增；
以全部基因組DNA為模板，以上游引物序列SEQ?ID?No.3下游引物序列SEQ?ID?No.4進行nxrB基因PCR擴增；
c)以羅氏454焦磷酸測序法分別nxrA基因PCR擴增產(chǎn)物和nxrB基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序；
d）采用Mothur軟件分別對nxrA基因PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果和nxrB基因PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果劃分操作分類單元；
e）選取具有97%相似度的操作分類單元序列與GenBank進行BLASTn比對，根據(jù)BLASTn比對結(jié)果，選擇相似度＞95%的序列，利用MEGA軟件分別對nxrA基因和nxrB基因劃分系統(tǒng)進化樹，即為污水中亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)；
nxrA基因和nxrB基因的不同操作分類單元的相對豐度即為污水中亞硝酸鹽氧化菌的豐度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，其特征在于，步驟b所述nxrA基因PCR擴增是指：
反應(yīng)體系：10×buffer?3μL，25mmol/L的MgCl21.8μL，5U/μL的Taq酶?0.2?μL，10mM的dTNP1.4μL，濃度均為10mM的正向引物SEQ?ID?No.1和反向引物SEQ?ID?No.2各0.3μL，20ng/μL的DNA模板2μL，無菌雙蒸水補足至30μL；
反應(yīng)條件：94℃下變性10min；94℃?30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃下延伸5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測污水中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，其特征在于，步驟b所述nxrB基因PCR擴增是指：
反應(yīng)體系：10×buffer?3μL，25mmol/L的MgCl21.8μL，濃度為5U/μL的Taq酶?0.2?μL，10mM的dTNP1.4μL，濃度均為10mM正向引物SEQ?ID?No.3和反向引物SEQ?ID?No.4各0.3μL，20ng/μL的DNA模板2μL，無菌雙蒸水補足至30μL；
反應(yīng)條件為：4℃下變性910min；94℃?30s，50℃-58℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃下延伸5min。
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