[發明專利]胸腺素α1的固相片段合成方法

有效

• 申請號: 201510031032.2
• 申請日: 2015-01-22
• 公開（公告）號: CN104558149B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 王良友;孫鋒;高魯;陳逸民;夏丹;黃保勝
• 申請（專利權）人: 蘇州天馬醫藥集團天吉生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 蘇州睿昊知識產權代理事務所(普通合伙) 32277
• 代理人: 伍見

1.一種胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：包括以下步驟：

胸腺素α1為：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述胸腺素α1從C端到N端分為C末端片段A、片段B和N末端片段E；所述C末端片段A為6個氨基酸，所述片段B為8個氨基酸，所述N末端片段E為4個氨基酸，所述C末端片段A和片段B在肽序上為連續片段；

所述C末端片段A通過以下工藝獲得：

步驟一、將Fmoc-Asn(Trt)-OH、HOBt在溶劑中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化液；

步驟二、將所述氨基酸活化液、Wang Resin樹脂混合并加入二甲氨基吡啶進行縮合反應獲得Fmoc-Asn²⁸(Trt)-Wang Resin，再去除Fmoc保護基；

步驟三、再根據肽序循環步驟一和步驟二，依次將Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH縮合到樹脂上，脫除Fmoc得到全保護C末端片段A的肽樹脂；

所述片段B通過以下工藝獲得：

步驟一、將Fmoc-Val-OH在溶劑中溶解后，加入所需DIPEA總量的2/3，活化形成氨基酸活化液；

步驟二、將所述氨基酸活化液、2-CTC Resin樹脂混合并加入剩余1/3DIPEA進行縮合反應獲得氨基酸-CTC Resin樹脂，再去除Fmoc保護基獲得脫保護氨基酸-CTCResin樹脂；

步驟三、將Fmoc-Glu(OtBu)-OH與HOBt在溶劑中溶解后，再加入DIC/HOBt活化形成氨基酸活化液；

步驟四、將步驟三所述氨基酸活化液、步驟二的脫保護氨基酸-CTC Resin樹脂混合進行縮合反應獲得中間氨基酸-CTC Resin樹脂；

步驟五、再根據肽序循環步驟三和步驟四，按照肽序依次將若干個氨基酸直到Fmoc-Asp(OtBu)-OH逐步縮合到步驟四的樹脂上，再通過體積比為1/4的TFE/DCM溶液將多肽與樹脂分離從而獲得全保護片段B；

將所述全保護片段B加入DCM/DMSO的混合溶劑，再依次加入DIC/HOBt活化后，再加入所述全保護C末端片段A的肽樹脂，縮合反應合成全保護片段C；

按照肽序，在全保護片段C的肽樹脂依次將Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH偶聯到全保護片段C上，脫除Fmoc保護基團后得到全保護片段D肽樹脂；

所述N末端片段E為逐步縮合法依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH與2-CTC Resin樹脂縮合，再將多肽與樹脂分離從而獲得片段E；

將片段E全溶解于DMF/DCM＝2/1的混合溶劑中，加入HOBt攪拌至全溶，再投入所述全保護片段D肽樹脂，得到胸腺素α1肽樹脂；

將胸腺素α1肽樹脂加入裂解混合試劑，裂解2h，濾除樹脂，得到濾液，將濾液緩緩加入至冰冷的無水乙醚中，靜置，去除上清液，離心、洗滌、真空干燥得到粗肽胸腺素α1。

2.根據權利要求1所述的胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：合成片段A時，制備Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin時，各原料的摩爾比為WangResin/Fmoc-Asn(Trt)-OH/DIC/HOBt/DMAP＝1/2～4/2～4/2～4/0.2～0.4，反應溫度為20～35℃，反應時間為1～2h。