[發明專利]一種miR?10b基因在胃癌基因表達調控中的應用

有效

• 申請號: 201510030461.8
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104611429B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 姚行;馬志紅;戴利成
• 申請（專利權）人: 湖州市中心醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種miR-10b基因在癌癥中的作用，具體涉及在胃癌中的應用。

背景技術

惡性腫瘤的侵襲轉移能力是腫瘤治療的一大難點。近些年來，微小RNA(microRNA,miRNA)的出現為研究腫瘤的發生及侵襲轉移機制提供了新的思路和途徑，微小RNA(miRNA)是一類內源性、保守、穩定的非編碼短單鏈RNA，在轉錄后水平調節靶基因表達miRNA在機體發育、細胞增殖、凋亡及腫瘤發生發展等生理和病理過程中發揮重要作用，成為當前生命科學研究的熱點。miRNA(microRNA)是廣泛存在于生物體內的19-25nt的非編碼單鏈小分子RNA，其通過與靶基因mRNA的互補配對降解靶mRNA或抑制其翻譯。研究表明miRNA在腫瘤發生過程中起重要作用，miRNA很有可能成為癌癥治療與診斷的新途徑。miRNA與靶基因mRNA的非編碼序列(3′-UTR或5′-UTR)存在著一對多的關系。在癌癥病例中經常發現miRNA群表達失調的現象，而這些miRNA表達的改變與癌癥發生密切相關。在體外實驗中，改變一個或者多個miRNA的表達能夠促進或者抑制癌細胞惡化，促進癌細胞惡化的miRNA可以認為是一類癌基因，反之，抑癌基因。miR-10b作為微小RNA家族中的一員，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質瘤、垂體瘤、急性髓性白血病等腫瘤組織中都有異常表達，并且與腫瘤的侵襲性和遠處轉移有密切關系。

胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，胃癌發病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區胃癌發病率比南方地區明顯為高。好發年齡在50歲以上，男女發病率之比為2：1。胃癌的預后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學行為以及治療措施有關。據世界衛生組織估計，2008年全球范圍內大約100萬胃癌新發病例，占全部腫瘤發病的7.8％，僅次于肺癌、乳腺癌和結直腸癌。超過70％的胃癌病例發生在發展中國家，其中50％發生在中國。在我國，胃癌年齡標化發病率男性為41.3/10萬，女性為18.5/10萬，僅次于肺癌。大約90％-95％的胃癌為腺癌，起源于胃部上皮組織。已有文獻報道miR-10b在多種癌中起到抑癌基因的作用。KLF4(Kriippel-like?factor4)是一種在多種人類組織中廣泛表達的鋅指轉錄因子，在許多不同的生理活動中具有重要作用，研究表明KLF4基因與多種腫瘤的發生發展有關，通過檢測癌組織中KLF4蛋白的表達，探討KLF4蛋白與胃癌臨床病理間的關系。

本發明擬在胃癌細胞中驗證KLF4是否是miR-10b的靶基因，并探討miR-10b在胃癌侵襲轉移中的調控機制，為胃癌的臨床治療提供理論依據。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術中上述缺陷，提供一種miR-10b基因作為KLF4靶基因的調控者在制備下調胃癌細胞中KLF4表達水平藥物中的應用。具體地，調節癌癥細胞中KLF4表達水平為miRNA-10b抑制KLF4的表達，其中癌癥細胞主要為胃癌細胞，并且其中所述miR-10b在RNA和蛋白水平同時調節靶基因KLF4的表達。本發明還提供了一種KLF4作為癌癥治療靶點在制備治療癌癥藥物中的用途，其中癌癥細胞主要為胃癌細胞。

本發明還提供了以下具體方法，研究KLF4是否是miR-10b的靶基因，具體為：

a)生物信息學方法對miR-10b的靶基因進行預測；

b)不同胃癌細胞中miR-10b、KLF4mRNA表達水平的相關性檢測；

c)熒光素酶報告驗證KLF4是miR-10b的靶基因；

d)建立穩定表達miR-10b的細胞株，熒光定量PCR技術和western?blot技術闡明miR-10b作用于靶基因KLF4的核酸水平或蛋白水平；

e)胃癌組織中驗證miR-10b和KLF4的表達相關性。

本發明培養多種胃癌細胞株，收集細胞進行總RNA抽提后，采用熒光定量PCR法檢測不同細胞中miR-10b，KLF4mRNA的表達水平。發現miR-10b與KLF4mRNA表達呈相反趨勢后，采用雙熒光素酶檢測法進一步驗證KLF4是miR-10b的直接靶基因。進一步采用熒光定量PCR，WesternBlot檢測上調miR-10b的表達對靶基因KLF4核酸和/或蛋白表達水平的調控方式。最后在臨床胃癌組織樣本中分析miR-10b和KLF4表達的相關性。