[發明專利]一株鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株及其應用

有效

• 申請號: 201510030418.1
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104745521B
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 于圣青;鄒潔馳;王小蘭;丁鏟;王少輝;韓先干;田明星
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海百一領御專利代理事務所(普通合伙)31243
• 代理人: 馬育麟

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一株鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株及其作為廣譜疫苗候選株應用于鴨疫里默氏桿菌油乳劑滅活疫苗。

背景技術

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)病又稱為鴨傳染性漿膜炎，是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的禽類接觸性傳染病。1-8周齡雛鴨十分易感，主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，發病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成的經濟損失重大，是當前危害養鴨業最為嚴重的傳染病之一。

鴨疫里默氏桿菌血清型復雜，目前世界范圍內已確認的RA血清型有21個(l～21型)，國內報道的血清型至少有13個，分別為血清型1、2、3、5、6、7、8、10、11、13、14、15及未定型，其中血清型1、2和10為國內引發感染的優勢血清型，各血清型之間缺乏有效的交叉保護^[1]。

近年來，我國鴨疫里默氏桿菌感染發病呈上升趨勢。該病的發展越來越復雜而且呈動態變化，使用藥物進行防治導致耐藥性的普遍產生，既增加防治成本，也給食品安全和人類健康帶來了極大危害，因此疫苗免疫是一種高效而經濟的手段。研究表明，同一鴨場的鴨群可以感染一種或同時感染幾種血清型的鴨疫里默氏桿菌，而且感染鴨疫里默氏桿菌的血清型還可能經常變化^[2]，因此理想的鴨疫里默氏桿菌疫苗應該可以同時提供針對幾種血清型的保護力。

目前國外已有商品化針對血清1、2、5型鴨疫里默氏桿菌的滅活疫苗和弱毒疫苗^[3][4]。針對血清1、2和10型鴨疫里默氏桿菌病的三價油乳劑滅活苗已有報道^[5]，具有較好的推廣價值，然而在制備疫苗時需要應用血清1、2和10型的三個菌株。因此，獲得對優勢流行血清型菌株具有交叉保護作用的鴨疫里默氏桿菌菌株用作廣譜疫苗候選株至關重要。研究表明，鴨疫里默氏桿菌伴侶蛋白GroEL和TonB依賴性受體TdR1蛋白(gi:312446409)對鴨疫里默氏桿菌1、2、10型菌株具有部分交叉保護力或交叉反應性^[6][7]，迄今尚無具有有效交叉保護力的鴨疫里默氏桿菌疫苗候選菌株報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一株鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1。

本發明的另一目的在于提供含鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1的廣譜疫苗。

本發明的再一目的提供該廣譜疫苗的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1中細菌脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌表面的主要抗原成分，決定細菌的血清型。本發明利用LPS單抗篩選CH3轉座子隨機突變庫，獲得一株鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1，該菌株缺失與LPS單抗結合的能力，表明其LPS的抗原性發生了變化。進一步的研究表明LPS抗原性發生變化的RA-M1菌株對血清1、2和10型強毒攻毒具有100％交叉保護性。

本發明所述鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株，命名為鴨疫里默氏桿菌Riemerella anatipestifer，已于2014年12月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，其保藏號為CGMCC No.10147。

本發明還提供一種含鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1的廣譜疫苗。

本發明所述鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1在用于制備疫苗中的應用。

本發明所述含鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株RA-M1的疫苗，包含菌量為6.7×10⁹CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株。

本發明所述的疫苗還包含Montanide ISA 70VG佐劑(賽比克Montanide ISA 70VG)。

其中，鴨疫里默氏桿菌脂多糖突變株與Montanide ISA 70VG佐劑的重量比為3:7。

本發明所述疫苗的劑型優選采用油乳劑。

本發明所述疫苗的制備方法，包括如下步驟：

1)先將RA-M1進行細菌培養，到生長期時加入0.4％的福爾馬林，37℃，200rpm振蕩培養18h滅活，根據細菌計數結果對滅活菌液進行配制，使其含菌量為6.7×10⁹CFU/mL；