[發明專利]抗牛支原體和巴氏桿菌混合蛋白噴霧劑

有效

• 申請號: 201510029569.5
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104771755B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 孔令聰;馬紅霞;唐燕;高鐸;劉樹明
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: A61K39/40
• 分類號: A61K39/40;A61K48/00;A61K9/12;A61P31/04
• 代理公司: 長春市東師專利事務所22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及抗牛支原體病和抗牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌病的藥物，抗牛支原體和巴氏桿菌混合蛋白噴霧劑。

背景技術

近年來，牛呼吸系統疾病已成為危害我國畜牧養殖業的主要疾病，該病發病率高達80%，單場死亡率高達60%。牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella mutocida，Pm）和牛支原體( Mycoplasma bovis，M.bovis)是引起我國牛呼吸系統疾病的主要病原，其引發的疾病已在我國多個省份流行，嚴重的制約了我國畜牧養殖業的健康發展。上述兩種疾病臨床癥狀有相似之處，臨床診斷需要細菌培養等措施，確診需要一段時間，由而且常常是并發感染。

目前，國內外還沒有有效的疫苗用于牛呼吸系統疾病的預防，獸醫臨床主要使用藥物對該病發生進行治療，但隨著抗生素廣泛不合理的使用，使牛呼吸系統疾病主要病原逐漸產生了耐藥性，不但給該病的防治工作帶來了困難，而且加劇了耐藥性問題造成的經濟損失。治療需要耐藥性篩選。延誤了治療時間。

發明內容

本發明的目的是為解決中治療牛呼吸系統疾病過程中，牛支原體和抗牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌具有耐藥性、診斷時間長、不能早期用藥的問題，而提供一種抗牛支原體及巴氏桿菌混合蛋白噴霧劑。

抗牛支原體和巴氏桿菌混合蛋白噴霧劑，它包括：每百克基質中，含抗牛支原體蛋白3-5g，抗牛多殺性巴氏桿菌蛋白3-5g；所述的抗牛支原體蛋白其氨基序列如序列表SEQ ID NO.3所示，抗牛多殺性巴氏桿菌蛋白其氨基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；

所述的基質為凝膠基質；

所述的基質為去乙酰結冷膠；

所述的抗牛支原體蛋白是由如序列表SEQ ID NO.1所示的基因編碼的，所述的抗牛多殺性巴氏桿菌蛋白是由如序列表SEQ ID NO.2所示的基因編碼的；

所述基因均來自于家蠅。

本發明提供了抗牛支原體和巴氏桿菌混合蛋白噴霧劑，它包括：每百克基質中，含抗牛支原體蛋白Md- UF1 3-5g，抗牛多殺性巴氏桿菌蛋白Md- AP2 3-5g，其基質為凝膠基質，本發明人將病原菌誘導家蠅幼蟲后構建的抑制性消減文庫中篩選到的分別能表達抗牛支原體蛋白的基因Md- UF1與表達抗牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌蛋白的基因Md- AP2構建成融合基因，表達了蛋白，實驗結果證明，對牛支原體和牛多殺性巴氏桿菌具有抑制作用。臨床治療牛支原體和巴氏桿菌混合感染引起的牛呼吸系統疾病，取得良好的效果。可對牛呼吸系統疾病早期用藥。

附圖說明

圖1 Md-UF1基因PCR擴增結果；其中，M: DL2000; 1: Md-UF1基因PCR產物；

圖2 Md-AP2基因PCR擴增結果；其中，M: DL2000; 1: Md-AP2基因PCR產物；

圖3，圖4純化的抗牛支原體、牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌蛋白Md- UF1，Md- AP2，SDS-PAGE分析結果。

具體實施方式

實施例1 Md- UF1、Md- AP2的克隆

1、用Promega公司生產的試劑盒（SV Total RNA Isolation）分別提取三日齡幼蟲用2、3日齡家蠅（Musca domestica L.）幼蟲（品種為綠頭蠅，蠅卵購買自吉林省遼源生態養殖廠，由吉林農業大學藥理與毒理實驗室孵育）總RNA，用TaKaRa公司生產的試劑盒Oligotex^TM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(From Total RNA)分離提純mRNA；

2、反轉錄合成cDNA第一鏈

（1）取兩個EP管，分別加入以下試劑見表1：

表1 反應體系

（2）吹打混勻，瞬時離心，PCR儀中72℃溫浴3min，42℃溫浴2min，然后瞬時離心，加入下列試劑見

（3）混勻，瞬時離心，PCR儀中42℃溫浴90min，70℃溫浴10min。

（4）瞬時離心，各加Tricine-EDTA Bufer250μL稀釋反應產物，于-80℃保存。