[發明專利]1?芘基?碳酰肼的合成及其衍生物在糖蛋白特異性預染檢測法中的應用

有效

• 申請號: 201510027542.2
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104529834B
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 王旭;玄元虎;周阿益;郁冬冬;洪國贏;朱忠欣;叢維濤;金利泰
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C07C281/06
• 分類號: C07C281/06;C09K11/06;G01N21/64
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技術領域

本發明涉及糖蛋白特異性熒光預染檢測技術，具體地說是1-芘基-碳酰肼(UGF202)的設計合成及其衍生物在糖蛋白特異性熒光預染檢測法中的應用。

背景技術

蛋白質糖基化修飾在生命科學研究領域具有至關重要的作用，作為最主要和普遍的蛋白質翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動物蛋白質中至少有二分之一發生了糖基化，這些糖蛋白廣泛分布于組織、細胞、體液中，特別是在細胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化對于蛋白質的折疊、運輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號轉導、細胞載附等諸多重要的生物過程。糖蛋白數量變化或糖鏈結構的改變，都可能導致疾病發生。不但目前已知的很多疾病的診斷標志物是糖蛋白，而且通過國際標準認證的藥物中，糖蛋白也占到較高的比例。

分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟，是下一步結構分析得以實施的基礎，目前凝膠上蛋白質染色主要分為預染及后染兩類。前者在電泳前對樣品進行處理，使染料特異性地與樣品內糖蛋白相結合，經電泳分離之后即可在相應激發波長下進行觀察，后染主要對電泳后的蛋白凝膠進行特異性染色。

目前糖蛋白檢測領域試劑盒主要集中于后染，且多數產品均以高附加值的價格在市場銷售，價格高昂，不利于生物技術基礎研究的發展。尤其國內利用現有的生物試劑進行生物實驗成本居高不下，無法實現經濟效益與實驗共同發展。糖蛋白特異性熒光預染檢測技術鮮有報道。本發明開發的UGF202及其衍生物熒光預染檢測方法靈敏度與經典的Pro-Q Emerald300染色法一致，是一種靈敏、便捷、特異的糖蛋白熒光預染檢測技術，有較好的基礎與臨床意義。

發明內容

本發明的目的在于提供UGF202的合成及其衍生物在糖蛋白特異性預熒光檢測中的應用。

本發明所述的UGF202相關化合物是指UGF202陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽等。

UGF202母核為：

為了實現本發明的目的，本發明還提供了應用UGF202進行糖蛋白特異性熒光預染檢測的方法包括如下步驟：

1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白樣品(不足1-20μL用重蒸水補足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光處進行氧化反應2-20min；優選的樣品體積為10μL，優選的高碘酸摩爾濃為0.03M，體積為10μL，優選的反應時間是5min；

2)在反應液中加入0.1-0.3M抗壞血酸1-10μL，搖勻反應0.1-5min；優選的抗壞血酸摩爾濃度是0.24M，體積為5μL，優選的反應時間是0.5min；

3)在反應液中加入UGF202或其衍生物按重量體積比1-5％二甲基亞砜溶液1-5μL，室溫下反應5-20min；優選的UGF202或其衍生物溶液為含重量體積是0.5％，體積為2.5μL，優選的反應時間是10min；

4)在反應液中加入10-50μL 3X蛋白質上樣緩沖液，搖勻；優選的體積為30μL；

5)電泳，觀察。

前期研究表明該技術有如下優點：

1)靈敏度高：UGF202糖蛋白特異性熒光預染檢測法靈敏度同Pro-Q Emerald 300靈敏度相當；

2)操作簡單迅速：省去后染必需的固定等操作步驟，可在15min內完成；電泳結束后即可觀察；

3)重現性好：受溫度、搖床擺動頻率等外部條件影響較小；

4)可逆性好：容易脫色；

5)質譜兼容性好：由于UGF202熒光預染檢測法不影響蛋白質結構，所以可與MALDI-TOF等質譜儀高度兼容；

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高實驗操作的安全性，對環境污染小；

7)成本低。

附圖說明

圖1.UGF202化學結構；