[發明專利]一種PEG-長鏈脂肪烷定點修飾的人生長激素及其制備方法

在審

• 申請號: 201510025897.8
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN104592382A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 胡濤;季韶洋;吳玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C07K14/61
• 分類號: C07K14/61;C07K1/107;A61K38/27;A61K47/48;A61P5/06
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種將PEG-長鏈脂肪烷定點修飾在人生長激素的N-末端，以及其制備方法。

背景技術

人生長激素(human?growth?hormone,hGH)是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質激素，有191個氨基酸殘基，分子量為22kDa，分子中無糖基，且具有4個α-螺旋和兩個鏈內二硫鍵。hGH通過與分布于組織細胞表面的生長激素受體結合而發揮其生理功能。hGH的主要生理功能包括間接的促細胞生長作用、直接的代謝調理作用和免疫調節作用。hGH可用于治療生長激素缺乏兒童矮小癥、Turner氏綜合癥、艾滋病消瘦、大面積創傷等疾病。由于hGH的分子量小、在體內易被腎小球過濾和酶降解，采取靜脈和皮下注射給藥會導致其在體內的血漿半衰期短。在臨床使用時需要頻繁給藥才能保持有效的血藥濃度和治療效果，這不僅在生理、心理和經濟上對患者造成了極大的負擔，且易產生耐受性及免疫排斥等不良反應。因此，開發耐受性好、省錢、且易為患者接受的hGH長效劑型已成為人們關注的焦點之一。

目前，用于延長蛋白質藥物血漿半衰期的方法主要基于化學修飾或者基因工程融合表達。其中，聚乙二醇(PEG)修飾和結合人血清白蛋白(HSA)是兩種常用的方法，可有效延長hGH的血漿半衰期，達到長效治療的目的。PEG是中性、無毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修飾可有效降低蛋白質的免疫原性和腎小球的過濾作用，從而延長蛋白質在體內的血漿半衰期。然而，PEG對蛋白質藥物的空間屏蔽作用會減弱蛋白質藥物與其受體的相互作用，從而導致其生物活性的降低，甚至完全喪失。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中含量最豐富的蛋白質，分子量約為66.5kDa，在人體內的血漿半衰期約為19天，具有安全無毒、生物相容性好、無免疫原性等特點。通過HSA與蛋白質藥物化學偶聯或者基因融合表達，可以顯著延長蛋白質藥物的血漿半衰期，同時降低其免疫原性和抗原性。然而，HSA的空間屏蔽作用極大地降低了蛋白質的生物活性。因此，臨床試驗結果開始質疑傳統蛋白質藥物長效劑型的研發策略，即通過增加血漿半衰期來提高藥效。

HSA由三個柔性的球形結構域(I、II和III)組成，并擁有5個長鏈脂肪酸(Myr1-5)結合位點，且解離常數在10^-8-10^-7M的范圍內。最近，人們研發了長鏈脂肪酸酰基化修飾的多肽藥物。其研發策略是通過長鏈脂肪酸與HSA的結合，延長多肽藥物的血漿半衰期；通過長鏈脂肪酸與HSA的緩慢釋放，逐步恢復多肽藥物的生物活性。例如，丹麥Novo?Nordisk公司通過十四烷酸(肉豆蔻酸)結合胰島素，開發了一種新型的長效胰島素(商品名：Levemir)，用于治療1型和2型糖尿病，并于2004年被美國FDA批準上市。隨后，該公司通過十六烷酸(棕櫚酸)結合胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，開發了一種新型的長效GLP-1(商品名：Liraglutide)，其中GLP-1的血漿半衰期從2分鐘延長到13小時。Liraglutide主要用于治療2型糖尿病，已于2010年被美國FDA批準上市。

在PEG修飾和長鏈脂肪酸酰基化修飾的基礎上，Kim等使用分子量為20kDa的分支型PEG，在其4個臂上分別連接了2個Exendin-4(Ex4)多肽分子和2個16碳的長鏈脂肪烷，用于治療2型糖尿病。其研究策略是通過修飾的PEG鏈和結合的HSA來延長Ex4的血漿半衰期。與未修飾的Ex4相比，修飾產物(Ex4-PEG-C16)的血漿半衰期和曲線下面積(AUC)增加了6倍。然而，該研究策略存在以下缺陷：(1)PEG的琥珀酰亞胺(NHS)基團會隨機修飾到Ex4賴氨酸殘基的ε-氨基和N-末端氨基酸殘基的α-氨基，而有些氨基酸殘基靠近Ex4的活性中心，修飾這些位點會顯著降低Ex4的生物活性；(2)高分子量的PEG(20kDa)由于能高效地結合水分子，會極大地降低HSA與十六烷的結合能力，不利于增加Ex4的血漿半衰期；(3)不能用于蛋白質藥物的化學修飾。將蛋白質直接加入混有有機溶劑的PEG化十六烷，有機溶劑會引起蛋白質沉淀，導致其生物活性的喪失；PEG鏈上的NHS基團在有機溶劑中穩定，而在水溶液中極易水解，在去除有機溶劑的過程中因NHS基團的水解而無法修飾蛋白質。因此，我們迫切需要研發針對蛋白質藥物的PEG-長鏈脂肪烷修飾技術，優化PEG連接橋的分子量，并將PEG-長鏈脂肪烷定點修飾到遠離蛋白質藥物活性中心的位點。

發明內容