[發明專利]一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 201510025002.0
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN104592372A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 郭金英;胡娟娟
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/34
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

1.一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法，其特征在于，制備步驟為：

步驟一、在無菌條件下，取活化后的發菜細胞種，置于液體培養基中進行培養18~22天，然后，將得到的發菜培養液以4000r/min的轉速進行離心分離8~12min，收集離心分離后得到的上層發菜細胞，轉置于培養瓶內的新鮮液體培養基中，將培養瓶放置在溫度為25℃的恒溫生化培養箱中，控制箱內光照強度為4000Lux，培養28~32天；

步驟二、將步驟一的培養物采用濾紙進行過濾，取濾液，得到去除藻體的培養液；

步驟三、按體積比為9:1的比例，取步驟二得到的培養液和NaCl摩爾濃度為0~0.25mol/L的浸提液置于錐形瓶中，充分搖勻混合后，轉置于超聲波震蕩器內進行超聲處理15~25min，然后，將得到的混合液置于溫度為30~80℃的水浴鍋內進行加熱1~6h，之后，對混合液進行過濾，所得濾液即為發菜糖蛋白混合溶液；

步驟四、將步驟三得到的發菜糖蛋白混合溶液置于旋轉蒸發器中進行減壓蒸發濃縮，控制減壓濃縮時的溫度為45~55℃，直至溶液體積為原體積的1/4，即得到糖蛋白樣品液；按體積比為1:4的比例，取糖蛋白樣品液和Sevage試劑，充分震蕩混合后得到下層含有凝膠沉淀的混合溶液，除去混合溶液中上下兩層交界處的變性蛋白，之后，在4℃條件下靜置10~20h，取混合溶液中的上層液，備用；

步驟五：分5次向步驟四得到的上層液中加入無水乙醇，使每次加入后混合溶液中乙醇的質量濃度分別為50%、60%、70%、80%和90%，且每次無水乙醇加入后均需將混合溶液置于4℃條件下靜置沉淀10~15h，收集每次靜置后得到的下層沉淀物，合并后備用；

步驟六：將步驟五收集到的沉淀物分別采用丙酮和乙醚各洗滌2~3次，然后，按照每克沉淀物加入1~3mL蒸餾水的比例進行復溶，之后，采用透析袋對復溶后的溶液進行透析脫鹽處理68~76h，然后，對處理后的溶液進行冷凍干燥，得到發菜糖蛋白粗品；

步驟七、按照0.2g:5mL的比例，將步驟六得到的發菜糖蛋白粗品溶解于去離子水中，然后用孔徑為0.45μm的膜對溶液進行過濾，之后，將得到的濾液上樣于DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離純化，并依次用摩爾濃度為0.05?mol/L、0.1mol/L和0.5mol/L的NaHCO₃溶液對交換柱進行階段性洗脫，每次洗脫的時間為120min，之后，采用紫外吸收法在波長為280nm處對發菜糖蛋白溶液的出峰位置進行檢測，并分別收集其第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰的發菜糖蛋白溶液，之后，對收集到的發菜糖蛋白溶液分別進行冷凍干燥，即得到不同分子量的發菜糖蛋白純品。

2.根據權利要求1所述的一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟一中的液體培養基為BG-11培養基。

3.根據權利要求1所述的一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟三中的浸提液為摩爾濃度為0.08mol/L的NaCl溶液。

4.根據權利要求1所述的一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟三中超聲波震蕩器的功率為500W。

5.根據權利要求1所述的一種懸浮培養發菜糖蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟四中所用的透析袋為3500Da透析袋。