[發明專利]一種山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基及制備方法

在審

• 申請號: 201510024477.8
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN104531594A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 趙萍;儲岳峰;賀英;陳勝利;劉永生;逯忠新
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

?本發明涉及一種細菌培養基及其制備方法，確切講本發明涉及一種山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基，以及這種培養基的制備方法。

背景技術

山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma?capricolum?subsp.?capripneumoniae?Mccp）,?是引起山羊傳染性胸膜肺炎（Contagious?capripleuropneumonia,?CCPP）的病原體,?原稱生物型F38,?最早是由Macowan于1976年在肯尼亞分離得到。隨后又在蘇丹、突尼斯、阿曼、土耳其、乍得、烏干達、埃塞俄比亞、尼日爾、坦桑尼亞和阿聯酋分離到。我國于2007年從山東分離出一株Mccp，并證實為山羊傳染性胸膜肺炎的病原（辛九慶，中國預防獸醫學報，2007）。山羊傳染性胸膜肺炎是山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病,?以呈現纖維素性肺炎和胸外膜炎為特征。

支原體是一類特殊的微生物，無細胞壁，生長條件嚴格，生長緩慢，由于其基因組較小，生物合成及代謝能力有限，病原細胞需要的多種營養物質需要從外界攝取，因此對培養基的要求較高（參考：支原體學?第2版?吳移謀，葉元康著）。

目前預防山羊傳染性胸膜肺炎的疫苗主要是滅活疫苗，制備疫苗時需要大量濃縮后才能達到所需的抗原濃度，因此培養基的成本不可忽視。高珊等（動物醫學進展，2013）對山羊支原體山羊肺炎亞種培養基進行了篩選研究，結果表明添加2g/L的丙酮酸鈉、200mL/L馬血清的Thiaucourt肉湯培養基生長速度更快、生長滴度更高。該培養基是由：PPLO肉湯?21?g/L，葡萄糖1g/L，丙酮酸鈉2g/L，質量體積比25%的酵母浸液100?ml/L，0.4%的酚紅0.18?ml/L，滅活馬血清200?mL/L,?及水溶解的青霉素200?IU/ml構成，其pH值為7.4~7.6。用此培養基培養的山羊支原體山羊肺炎亞種，66小時生長滴度達到4×10⁹ccu。

發明內容

本發明提供一種較現有技術的培養成本更低、生長時間更短的山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基，同時提供這種培養基的制備方法。

本發明的一種山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養是由：PPLO肉湯?21?g/L，葡萄糖2g/L，丙酮酸鈉2g/L，質量體積比25%的酵母浸液100?ml/L，0.4%的酚紅0.18?ml/L，滅活馬血清100?mL/L,?及水溶解的青霉素200?IU/ml構成，其pH值為7.4~7.6。

本發明的山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基制備方法是：將PPLO肉湯、葡萄糖、丙酮酸鈉、酵母浸液和酚紅混合后,121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至常溫，再加入無菌滅活馬血清,?再在其中加經滅菌水溶解的青霉素，用氫氧化鈉溶液調整pH值至7.4~7.6。

本發明在高珊等研究基礎上將Thiaucourt肉湯培養基中的葡萄糖由原來的1g/L增加到2g/L，馬血清由原來的20%降低到10%，這樣所得到的培養基可使生長速度有所提高，同時能使培養成本有所降低。采用本發明的培養基培養山羊支原體山羊肺炎亞種，56小時生長滴度可達到4×10⁹ccu，在達到原有培養基生長滴度的同時，培養時間縮短10小時，更重要的是，相對于廉價葡萄糖的相對增加及昂貴馬血清的大幅度減少，培養基的成本降低很多。

根據前述方法可制備出山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養基。經過反復試驗表明，采用本發明的培養基培養山羊支原體山羊肺炎亞種，56小時生長滴度可達到4×10⁹ccu，在達到原有培養基生長滴度的同時，培養時間縮短10小時，更重要的是，相對于廉價葡萄糖的相對增加及昂貴馬血清的大幅度減少，培養基的成本降低很多--配制1000mL本發明的培養基與高珊等改進的培養基相比成本可減少約150元。

具體實施方式

以下是本發明的一個實施例。

配置1000mL本發明的培養基：首先量取500mL的雙蒸水，然后秤取PPLO肉湯?21?g,?葡萄糖2g，丙酮酸鈉2g，加入25%（m/v）酵母浸液100?ml,?0.4%酚紅0.18?ml,?用雙蒸水定容到900?mL,121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至常溫，加無菌滅活馬血清100?mL,?加經滅菌水溶解的青霉素200?IU/ml，用氫氧化鈉溶液調整pH值至7.4~7.6。