[發明專利]一種改良的擴增受阻突變檢測體系引物及應用

無效

• 申請號: 201510023443.7
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104531889A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 張翼飛;齊飛虎
• 申請（專利權）人: 江蘇宏泰格爾生物醫學工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王倩

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種改良的擴增受阻突變檢測體系引物及應用。

背景技術

肺癌是當今最常見的惡性腫瘤之一，也是高致死率的癌癥之一，其中80-85％的患者為非小細胞肺癌(non-small?cell?lung?cancers，NSCLC)。近年來隨著分子生物學水平的提高，產生了針對分子靶點的抗腫瘤藥物。這些藥物針對性強，能特異的殺傷腫瘤細胞，效果顯著。其中以表皮生長因子受體(Epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)為靶點的酪氨酸激酶抑制劑在非小細胞肺癌治療中日漸突出。EGFR作為癌癥治療的靶點，靶向藥物主要有兩類：一類是作用于受體胞內的小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine?kinase?inhibitor，TKI)主要包括吉非替尼、埃羅替尼、EKB-569、PKI-166、GW-2016及CI-1033；另一類是作用于受體胞外區的單克隆抗體(MAb)，包括西妥昔單抗(cetuximab)、ABX-EGF及EMD72000。這些藥物通過阻斷EGFR的活性抑制其磷酸化和信號傳導，從而起到抗腫瘤作用，同時也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。

大量研究表明，并非所有肺癌患者從TKI治療獲益，EGFR突變與TKI療效相關。攜帶EGFR基因突變的NSCLC患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時療效顯著，但是研究發現EGFR外顯子20上的T790M位點和插入為耐藥位點，會抑制易瑞沙和特羅凱等藥物療效。臨床檢測這些突變能夠很好地預測TKI治療效果，為腫瘤用藥提供指導依據。

擴增受阻突變檢測體系(Amplification?refractory?mutation?system，ARMS)，又稱等位基因特異PCR(Allele-specific?PCR，AS-PCR)，是目前應用最廣的突變檢測技術，其原理利用Taq酶缺失校正活性完成突變的檢測。在ARMS的反應體系中，引物上標記2個不同熒光素、或加入熒光探針等?方法都是以實時熒光PCR為基礎的基因分型方法。可檢測出樣品中含量低至0.1-1.0％的突變基因。目前，該方法已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。ARMS引物設計時，通常在3’-末端起第2個堿基位置加入錯配，以抑制野生型模板的擴增，因此ARMS具有很好的SNP檢測能力；然而，ARMS技術的缺點在于敏感性較低，只能檢測10個拷貝左右的突變。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種有效提高ARMS引物的敏感性和特異性的改良的擴增受阻突變檢測體系引物。

本發明的改良的擴增受阻突變檢測體系引物，包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的5’末端引入2-3個不與靶序列配對的堿基，并且所述上游引物3’末端倒數第三個堿基位置引入錯配堿基。

進一步的，所述上游引物5’末端引入的堿基為GG、CC或CG。

進一步的，所述上游引物3’末端的錯配堿基為強錯配堿基和中強錯配堿基，所述強錯配堿基包括C-T和G-A，所述中強錯配堿基包括A-A、G-G和C-C。

本發明的另一目的是提供一種改良的擴增受阻突變檢測體系引物在擴增受阻突變檢測體系中的應用。

本發明的另一目的是提供一種引物，用于采用擴增受阻突變檢測體系檢測EGFR21外顯子L858R?G>T突變，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的5’末端引入2-3個不與靶序列配對的堿基，并且所述上游引物3’末端倒數第三個堿基位置引入錯配堿基。

進一步的，所述上游引物5’末端引入的堿基為GG、CC或CG。

進一步的，所述上游引物3’末端的錯配堿基為強錯配堿基和中強錯配堿基，所述強錯配堿基包括C-T和G-A，所述中強錯配堿基包括A-A、G-G和C-C。

進一步的，所述上游引物為具有SEQ?ID?NO：1所示序列的上游引物，所述下游引物為具有SEQ?ID?NO：4所示序列的下游引物。

本發明的另一目的是提供一種檢測EGFR21外顯子L858R?G>T突變的試劑盒，其特征在于：包括具有SEQ?ID?NO：1的上游引物以及具有SEQ?ID?NO：4所示序列的下游引物。

進一步的，還包括具有SEQ?ID?NO：5的Taqman探針，所述Taqman探針的5’末端和3’末端分別被FAM和BHQ1標記。