[發(fā)明專利]倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510022431.2
• 申請(qǐng)日: 2015-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN104597016B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李劍;李瑞元;曾琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法。

背景技術(shù)

激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技產(chǎn)品，它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，把光學(xué)成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca²⁺、pH值，膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。

從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測(cè)光通過透鏡聚焦到被觀測(cè)物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦顯微鏡[ConfocalLaserScanningMicroscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(BeamSplitter)，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔（Pinhole）的擋板，小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè)光電倍增管（pHotomultipliertube，PMT）。可以想像，探測(cè)光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測(cè)量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意義是：通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對(duì)一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。

激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞等，觀察研究組織切片，細(xì)胞活體的生長發(fā)育特征，研究測(cè)定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換。能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和pH值變化研究（RATIO），神經(jīng)遞質(zhì)研究，微分干涉及熒光的斷層掃描，多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B，熒光光譜分析熒光各項(xiàng)指標(biāo)定量分析熒光樣品的時(shí)間延遲掃描及動(dòng)態(tài)構(gòu)件組織與細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件，熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析，熒光原位雜交研究（FISH），細(xì)胞骨架研究，基因定位研究，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白恢復(fù)研究（FRAP），胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動(dòng)性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。

但是共聚焦顯微鏡對(duì)樣品要求較高，常規(guī)只能進(jìn)行玻片和培養(yǎng)皿的觀察，并且高倍的活細(xì)胞觀察只能在特制的培養(yǎng)皿中完成，無法進(jìn)行動(dòng)植物活體成像，使得其本身具有的多通道熒光同時(shí)檢測(cè)，以及多色熒光視頻錄制的功能在需要活體觀察的領(lǐng)域使用范圍受到了局限。近期我們移植的轉(zhuǎn)染GFP的干細(xì)胞的成活和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，只能通過殺死動(dòng)物后制作玻片進(jìn)行檢測(cè)，必須在顯微鏡觀察之前對(duì)樣品進(jìn)行固定切片等一系列操作，得到的結(jié)果因?yàn)椴僮鞑襟E多，與動(dòng)植物活體時(shí)的狀態(tài)有較大差異。在藥物效果監(jiān)測(cè)方面的病理切片會(huì)受到藥物體內(nèi)代謝，動(dòng)物體本身差異等影響導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可靠性較差。當(dāng)我們獲得了一個(gè)比較理想的切片結(jié)果，需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)處死，無法執(zhí)行，新的動(dòng)物模型必然與原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有差異，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和結(jié)果可靠性較差。

因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測(cè)技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法，本發(fā)明將傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)放到動(dòng)植物活體上來進(jìn)行，并可用激光共聚焦顯微鏡觀察動(dòng)植物活體局部器官組織內(nèi)部的高精度顯微圖像，結(jié)果更加可靠。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置，包括共聚焦樣品平臺(tái)、負(fù)壓產(chǎn)生裝置和倒置式顯微鏡；

所述的負(fù)壓產(chǎn)生裝置包括電機(jī)、負(fù)壓泵和廢液罐；所述電機(jī)用于驅(qū)動(dòng)負(fù)壓泵，所述負(fù)壓泵的進(jìn)氣口通過第一耐壓軟管與廢液罐的出氣口相連通，負(fù)壓泵的出口連通大氣；

廢液罐的進(jìn)氣口通過第二耐壓軟管與鋼管相連通，所述的共聚焦樣品平臺(tái)中間設(shè)有凹槽，凹槽底部設(shè)有通孔，通孔處設(shè)有玻片，玻片通過凡士林與通孔密封連接；

所述的鋼管與凹槽相連通；倒置式顯微鏡位于共聚焦樣品平臺(tái)的正下方。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的鋼管通過環(huán)氧樹脂固定與共聚焦樣品平臺(tái)固定連接。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的鋼管的彎折部分采用圓角折彎，保持內(nèi)部暢通。鋼管的作用為導(dǎo)流氣體及廢液。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的凹槽為倒置的圓臺(tái)形。

用上述倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置進(jìn)行動(dòng)植物活體觀測(cè)方法，包括如下步驟：

步驟（1），確認(rèn)熒光指示劑標(biāo)記方案并進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記；