[發明專利]倒置激光共聚焦顯微鏡動植物活體觀測裝置及方法

有效

• 申請號: 201510022431.2
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104597016B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 李劍;李瑞元;曾琳
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生

技術領域

本發明屬于微觀組織及結構觀測技術領域，具體涉及一種倒置激光共聚焦顯微鏡動植物活體觀測裝置及方法。

背景技術

激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀80年代發展起來的一項具有劃時代意義的高科技產品，它是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，把光學成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可見光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡在亞細胞水平上觀察諸如Ca²⁺、pH值，膜電位等生理信號及細胞形態的變化，成為形態學、分子生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等領域中新一代強有力的研究工具。

從一個點光源發射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦顯微鏡[ConfocalLaserScanningMicroscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(BeamSplitter)，將已經通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔（Pinhole）的擋板，小孔就位于焦點處，擋板后面是一個光電倍增管（pHotomultipliertube，PMT）。可以想像，探測光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。于是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。其意義是：通過移動透鏡系統可以對一個半透明的物體進行三維掃描。

激光共聚焦成像系統能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標記的組織和細胞等，觀察研究組織切片，細胞活體的生長發育特征，研究測定細胞內物質運輸和能量轉換。能夠進行活體細胞中離子和pH值變化研究（RATIO），神經遞質研究，微分干涉及熒光的斷層掃描，多重熒光的斷層掃描及重疊，熒光光譜分析熒光各項指標定量分析熒光樣品的時間延遲掃描及動態構件組織與細胞的三維動態結構構件，熒光共振能量的轉移的分析，熒光原位雜交研究（FISH），細胞骨架研究，基因定位研究，原位實時PCR產物分析，熒光漂白恢復研究（FRAP），胞間通訊研究，蛋白質間研究，膜電位與膜流動性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。

但是共聚焦顯微鏡對樣品要求較高，常規只能進行玻片和培養皿的觀察，并且高倍的活細胞觀察只能在特制的培養皿中完成，無法進行動植物活體成像，使得其本身具有的多通道熒光同時檢測，以及多色熒光視頻錄制的功能在需要活體觀察的領域使用范圍受到了局限。近期我們移植的轉染GFP的干細胞的成活和轉移實驗，只能通過殺死動物后制作玻片進行檢測，必須在顯微鏡觀察之前對樣品進行固定切片等一系列操作，得到的結果因為操作步驟多，與動植物活體時的狀態有較大差異。在藥物效果監測方面的病理切片會受到藥物體內代謝，動物體本身差異等影響導致檢測結果可靠性較差。當我們獲得了一個比較理想的切片結果，需要進行下一步實驗的時候，原實驗動物已經處死，無法執行，新的動物模型必然與原實驗動物有差異，實驗可重復性和結果可靠性較差。

因此如何克服現有技術的不足是目前微觀組織及結構觀測技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種倒置激光共聚焦顯微鏡動植物活體觀測裝置及方法，本發明將傳統細胞生物學的實驗放到動植物活體上來進行，并可用激光共聚焦顯微鏡觀察動植物活體局部器官組織內部的高精度顯微圖像，結果更加可靠。

本發明采用的技術方案如下：

倒置激光共聚焦顯微鏡動植物活體觀測裝置，包括共聚焦樣品平臺、負壓產生裝置和倒置式顯微鏡；

所述的負壓產生裝置包括電機、負壓泵和廢液罐；所述電機用于驅動負壓泵，所述負壓泵的進氣口通過第一耐壓軟管與廢液罐的出氣口相連通，負壓泵的出口連通大氣；

廢液罐的進氣口通過第二耐壓軟管與鋼管相連通，所述的共聚焦樣品平臺中間設有凹槽，凹槽底部設有通孔，通孔處設有玻片，玻片通過凡士林與通孔密封連接；

所述的鋼管與凹槽相連通；倒置式顯微鏡位于共聚焦樣品平臺的正下方。

進一步，優選的是所述的鋼管通過環氧樹脂固定與共聚焦樣品平臺固定連接。

進一步，優選的是所述的鋼管的彎折部分采用圓角折彎，保持內部暢通。鋼管的作用為導流氣體及廢液。

進一步，優選的是所述的凹槽為倒置的圓臺形。

用上述倒置激光共聚焦顯微鏡動植物活體觀測裝置進行動植物活體觀測方法，包括如下步驟：

步驟（1），確認熒光指示劑標記方案并進行相應標記；