[發(fā)明專利]倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201510022431.2 | 申請(qǐng)日: | 2015-01-16 |
| 公開(公告)號(hào): | CN104597016B | 公開(公告)日: | 2018-01-16 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 李劍;李瑞元;曾琳 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 |
| 主分類號(hào): | G01N21/64 | 分類號(hào): | G01N21/64 |
| 代理公司: | 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司53100 | 代理人: | 金耀生 |
| 地址: | 650223 *** | 國省代碼: | 云南;53 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 倒置 激光 聚焦 顯微鏡 動(dòng)植物 活體 觀測(cè) 裝置 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法。
背景技術(shù)
激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技產(chǎn)品,它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,把光學(xué)成像的分辨率提高了30%~40%,使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針,從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值,膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化,成為形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。
從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測(cè)光通過透鏡聚焦到被觀測(cè)物體上,如果物體恰在焦點(diǎn)上,那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源,這就是所謂的共聚焦,簡稱共焦。共焦顯微鏡[ConfocalLaserScanningMicroscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(BeamSplitter),將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向,在其焦點(diǎn)上有一個(gè)帶有針孔(Pinhole)的擋板,小孔就位于焦點(diǎn)處,擋板后面是一個(gè)光電倍增管(pHotomultipliertube,PMT)。可以想像,探測(cè)光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng),必不能聚焦到小孔上,會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測(cè)量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意義是:通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對(duì)一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。
激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞等,觀察研究組織切片,細(xì)胞活體的生長發(fā)育特征,研究測(cè)定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換。能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和pH值變化研究(RATIO),神經(jīng)遞質(zhì)研究,微分干涉及熒光的斷層掃描,多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B,熒光光譜分析熒光各項(xiàng)指標(biāo)定量分析熒光樣品的時(shí)間延遲掃描及動(dòng)態(tài)構(gòu)件組織與細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件,熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析,熒光原位雜交研究(FISH),細(xì)胞骨架研究,基因定位研究,原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析,熒光漂白恢復(fù)研究(FRAP),胞間通訊研究,蛋白質(zhì)間研究,膜電位與膜流動(dòng)性等研究,完成圖像分析和三維重建等分析。
但是共聚焦顯微鏡對(duì)樣品要求較高,常規(guī)只能進(jìn)行玻片和培養(yǎng)皿的觀察,并且高倍的活細(xì)胞觀察只能在特制的培養(yǎng)皿中完成,無法進(jìn)行動(dòng)植物活體成像,使得其本身具有的多通道熒光同時(shí)檢測(cè),以及多色熒光視頻錄制的功能在需要活體觀察的領(lǐng)域使用范圍受到了局限。近期我們移植的轉(zhuǎn)染GFP的干細(xì)胞的成活和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),只能通過殺死動(dòng)物后制作玻片進(jìn)行檢測(cè),必須在顯微鏡觀察之前對(duì)樣品進(jìn)行固定切片等一系列操作,得到的結(jié)果因?yàn)椴僮鞑襟E多,與動(dòng)植物活體時(shí)的狀態(tài)有較大差異。在藥物效果監(jiān)測(cè)方面的病理切片會(huì)受到藥物體內(nèi)代謝,動(dòng)物體本身差異等影響導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可靠性較差。當(dāng)我們獲得了一個(gè)比較理想的切片結(jié)果,需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)處死,無法執(zhí)行,新的動(dòng)物模型必然與原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有差異,實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和結(jié)果可靠性較差。
因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測(cè)技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置及方法,本發(fā)明將傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)放到動(dòng)植物活體上來進(jìn)行,并可用激光共聚焦顯微鏡觀察動(dòng)植物活體局部器官組織內(nèi)部的高精度顯微圖像,結(jié)果更加可靠。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置,包括共聚焦樣品平臺(tái)、負(fù)壓產(chǎn)生裝置和倒置式顯微鏡;
所述的負(fù)壓產(chǎn)生裝置包括電機(jī)、負(fù)壓泵和廢液罐;所述電機(jī)用于驅(qū)動(dòng)負(fù)壓泵,所述負(fù)壓泵的進(jìn)氣口通過第一耐壓軟管與廢液罐的出氣口相連通,負(fù)壓泵的出口連通大氣;
廢液罐的進(jìn)氣口通過第二耐壓軟管與鋼管相連通,所述的共聚焦樣品平臺(tái)中間設(shè)有凹槽,凹槽底部設(shè)有通孔,通孔處設(shè)有玻片,玻片通過凡士林與通孔密封連接;
所述的鋼管與凹槽相連通;倒置式顯微鏡位于共聚焦樣品平臺(tái)的正下方。
進(jìn)一步,優(yōu)選的是所述的鋼管通過環(huán)氧樹脂固定與共聚焦樣品平臺(tái)固定連接。
進(jìn)一步,優(yōu)選的是所述的鋼管的彎折部分采用圓角折彎,保持內(nèi)部暢通。鋼管的作用為導(dǎo)流氣體及廢液。
進(jìn)一步,優(yōu)選的是所述的凹槽為倒置的圓臺(tái)形。
用上述倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測(cè)裝置進(jìn)行動(dòng)植物活體觀測(cè)方法,包括如下步驟:
步驟(1),確認(rèn)熒光指示劑標(biāo)記方案并進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記;
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- 專利分類
G01N 借助于測(cè)定材料的化學(xué)或物理性質(zhì)來測(cè)試或分析材料
G01N21-00 利用光學(xué)手段,即利用紅外光、可見光或紫外光來測(cè)試或分析材料
G01N21-01 .便于進(jìn)行光學(xué)測(cè)試的裝置或儀器
G01N21-17 .入射光根據(jù)所測(cè)試的材料性質(zhì)而改變的系統(tǒng)
G01N21-62 .所測(cè)試的材料在其中被激發(fā),因之引起材料發(fā)光或入射光的波長發(fā)生變化的系統(tǒng)
G01N21-75 .材料在其中經(jīng)受化學(xué)反應(yīng)的系統(tǒng),測(cè)試反應(yīng)的進(jìn)行或結(jié)果
G01N21-84 .專用于特殊應(yīng)用的系統(tǒng)





