[發明專利]一種耐有機溶劑蛋白酶PT121或其突變體高效合成芐氧羰基阿斯巴甜的工藝

在審

• 申請號: 201510021877.3
• 申請日: 2015-01-15
• 公開（公告）號: CN104593463A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 何冰芳;朱玲;朱富成;劉可可;吳斌;柏中中
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明涉及基因工程和生物催化工程研究領域，具體涉及一種耐有機溶劑蛋白酶PT121或其突變體高效合成芐氧羰基阿斯巴甜的工藝。

背景技術

近年來蛋白酶催化合成小分子化合物越來越受到人們的關注，其可進行小肽合成、糖軛合物、水凝膠分子自組裝、轉酯反應以及手性醇動力學拆分等，在醫藥中間體、化妝品、日用品、生物材料等領域具有廣泛的應用前景。然而大多數耐有機溶劑蛋白酶的催化效率不是很高，所以，篩選出具有高催化效率的蛋白酶的對于蛋白酶在非水相或者水相催化在工業上的發展與應用具有突出的意義。

阿斯巴甜是由L型天冬氨酸和L型苯丙氨酸甲酯縮合而成的一種二肽甲酯化合物，是一種人工合成的甜味劑。阿斯巴甜的甜味大約是蔗糖的200倍，在甜味劑的添加方面具有很廣的應用范圍。Magnuson?B?A等（Critical?Reviews?in?Toxicological?37（8）：629-727）研究了阿斯巴甜的藥理學毒性，研究表明在目前的食品添加范圍內阿斯巴甜對人體是非常安全的。

目前報道的阿斯巴甜主要通過兩種方法來合成，化學法、酶與化學法混合。在化學法的合成中具有很大的弊端，需要對天冬氨酸的氨基和β-羧基進行保護，并且還需要對α-羧基進行活化處理，反應的過程中伴隨著少量的β位副產物以及少量由于消旋作用產生的D型副產物，由于D型阿斯巴甜具有苦味，所以在后期還需要對副產物進行分離。在進行氨基酸保護和脫保護的過程中影響產物的總收率，整個過程步驟繁瑣，污水排放嚴重。

采用嗜熱蛋白酶或者嗜熱蛋白酶與化學法結合的方法生產阿斯巴甜，能夠利用β位未保護的芐氧羰基天冬氨酸高產率的生產出不含β型副產物的α型阿斯巴甜，并且沒有消旋作用產生的D型產物。由于蛋白酶具有特殊的催化位點選擇性，所以能生產出完全不含β型副產物的阿斯巴甜。然而酶法這項技術也有很大的缺點，日本專利JP60118190在使用嗜熱蛋白酶合成阿斯巴甜的過程中，反應體系采用雙相法高效的合成阿斯巴甜前體，將反應生成的產物相轉移至有機相。這一反應工藝在底物和產物在兩相中的分配難以把握，而且轉移至有機相中的產物的后分離的過程中能源浪費較大。

在合成阿斯巴甜前體（芐氧羰基阿斯巴甜）的過程中，底物對酶的抑制性很明顯，底物的濃度相對較低。在工業化應用方面有一定的難度。Hiroyasu?Ogino等（“Enhancement?of?the?aspartame?precursor?synthetic?activity?of?an?organic?solvent-stable?protease”，Protein?Engineering,?Design?&?Selection?vol.23?no.3?pp.?147–152,?2010）開發的耐有機溶劑蛋白酶PST-01在催化合成阿斯巴甜前體時芐氧羰基天冬氨酸（Cbz-Asp）的最佳濃度為30mM，苯丙氨酸甲酯（PheOMe）的最佳濃度為500mM，芐氧羰基阿斯巴甜（Cbz-APM）的產率達到83%，此工藝反應體系中的芐氧羰基天冬氨酸的濃度低，其底物的摩爾比不經濟，且在反應體系中使用了百分之五十的DMSO，產物與底物均溶于溶液中導致繁雜的后分離等步驟，難以實現酶法工業化生產阿斯巴甜。

美國專利US2012/0295294采用耐有機溶劑蛋白酶PT121合成阿斯巴甜，該專利在合成阿斯巴甜的過程中使用非保護天冬氨酸，兩底物的摩爾比為1:20，但是底物投入量高產率僅為30.8%，形成了底物的大量浪費，產物在有機相中分離難度大，其產業化的價值低。

有鑒于現有工藝的不足，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于對本發明人團隊在先授權專利的來自于Pseudomonas?aeruginosa耐有機溶劑蛋白酶PT121進行定向的進化,以得到具有更高催化效率的蛋白酶并提供一種化學酶法高效率經濟合成阿斯巴甜的工藝，采用蛋白酶PT121或其突變體催化合成阿斯巴甜前體（Cbz-APM）的反應分離耦合工藝，能夠很好地解決了底物抑制性，底物的利用率及產物的后期分離等問題。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種耐有機溶劑蛋白酶PT121或其突變體高效合成芐氧羰基阿斯巴甜的工藝，具體為耐有機溶劑蛋白酶PT121或其突變體催化芐氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其鹽酸鹽酶法合成芐氧羰基阿斯巴甜。