[發明專利]用于快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的分子標記、引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201510020263.3
• 申請日: 2015-01-15
• 公開（公告）號: CN104593497A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 鐘軍;戴林建
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的分子標記、引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術

根據大量資料統計，鉀是烤煙吸收量和體內含量最高的營養元素，也是影響我國烤煙質量進一步提高的重要限制因素。而我國大多數植煙土壤不能提供充足的鉀供給烤煙以滿足優質煙葉生產的需求。因此，生產上需要投入大量的鉀肥。連年大量施用化肥，不但增加煙農的生產成本，而且加速土壤理化性質的惡化。遺憾的是我國優質煙葉平均鉀含量依然較低，與國外優質煙葉相比至少還低20％以上(我國優質煙葉2％左右，國外優質煙葉大2.5％)。影響烤煙體內鉀含量的因素有許多，主要有：土壤和氣候；栽培措施；品種或基因型等。土壤和氣候是自然形成的，人類較難改變。栽培措施提高煙葉鉀含量，多年實踐證明有一定的局限性，何況再增加鉀肥用量也不可取。因此，選育高鉀含量烤煙新品種將是解決烤煙鉀含量的關鍵途徑之一。

然而選育高鉀含量烤煙時需要對成熟期的葉片進行化學分析，所需時間比較長；熒光定量RT-PCR(實時熒光定量PCR)技術是在普通PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號監測整個PCR反應的進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且還具有特異性強、能有效解決PCR污染問題和自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種熒光定量RT-PCR檢測鉀相關基因在煙草葉片中的表達情況，從而檢測煙草葉片中鉀含量的高低。

一種用于快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的分子標記，序列如SEQ?NO:1。

一種快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的RT-PCR擴增方法所用的引物，序列如下：

正向序列F：5’-CCCTTATGTC?AGCACCAGAA-3’；

反向序列R：5’-GCTGGCAACTGTGGA?AGGAT-3’。

一種快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的試劑盒，包括所述的引物，以及進行RT-PCR反應所需的各種試劑。

RT-PCR反應所需的各種試劑包括：10×Buffer、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶。

一種快速檢測烤煙煙葉鉀含量高低的RT-PCR擴增方法，

首先提取待檢測烤煙的RNA，然后在反轉錄酶的作用下將其RT-PCR反轉錄成cDNA，最后以煙草cDNA為模板，以權利要求2所述的核酸分子為引物，進行PCR擴增，擴增出2165bp大小的DNA片段，表明被檢測烤煙擁有鉀相關基因存在與表達，然后根據熒光值變化曲線和融解曲線計算煙葉的含鉀量。

PCR體系包括12.5μL?SYBR?Green?Realtime?PCR?Master?Mix，10μmol?L^–1PCR上下游引物各0.5μL，100ng/μL模板cDNA5μL，補蒸餾水至總體積25μL。

PCR反應條件：50℃25min→5個循環：包括95℃30s和65℃30s→30個循環：包括95℃5s和55℃35s。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的，其步驟如下：

1、采用SSR分子標記技術，用其100個引物(PT20189-PT20288，購自上海生工)對所用烤煙材料進行PCR擴增，其中引物PT20287可以擴增區分出高鉀和低鉀含量的烤煙煙葉，其大小約為2000bp左右(圖1)。

2、用細菌質粒M13對在步驟1中獲得的序列進行克隆后，用核酸自動分析序列儀測定該標記的堿基構成及其序列；

3、對步驟2中測定的DNA進行序列分析，并按照所獲序列為依據，利用DNA合成儀，人工合成寡聚核苷酸(正向序列F?5’-CCCTTATGTC?AGCACCAGAA-3’；反向序列R5’-GCTG?GCAACT?GTGGAAGGAT-3’)；

4、利用步驟3中的引物對8個烤煙材料cDNA進行RT-PCR擴增后進行電泳檢測，結果表明高鉀含量烤煙材料的DNA濃度在2165bp處較高，而低鉀含量烤煙材料則較低(圖2)。

5、對步驟4中進行RT-PCR擴增后的產物進行熒光值變化曲線和融解曲線分析，定量計算不同材料與鉀相關基因的表達量。