[發(fā)明專(zhuān)利]一套提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201510018359.6 | 申請(qǐng)日： | 2015-01-14 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN104561090B | 公開(kāi)（公告）日： | 2017-09-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 丁莉萍;張杰偉;王宏芝;陳亞娟;張中保;魏建華 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 北京市農(nóng)林科學(xué)院 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N15/84 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N15/84;A01H5/00 |
| 代理公司： | 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245 | 代理人： | 關(guān)暢,任鳳華 |
| 地址： | 100097 *** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一套 提高 根癌農(nóng) 桿菌 楊樹(shù) 遺傳 轉(zhuǎn)化 效率 方法 | ||
1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括M1)和M2)：
M1)用含有目的DNA的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染楊樹(shù)的外植體得到轉(zhuǎn)染的外植體；
M2)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的外植體得到外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株；
所述外植體的制備方法如下：將楊樹(shù)組培苗的葉片從垂直主脈方向一分為二，得到近葉柄端半葉片和遠(yuǎn)葉柄端半葉片；將所述近葉柄端半葉片的葉邊緣去除得到所述外植體；
所述楊樹(shù)組培苗按照如下方法獲得：將無(wú)菌楊樹(shù)頂芽接入生根培養(yǎng)基在光照下培養(yǎng)20天得到所述楊樹(shù)組培苗；
所述培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的外植體得到外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株包括A1)-A5)：
A1)共培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的外植體，得到共培養(yǎng)的外植體；
A2)將所述共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，得到恢復(fù)培養(yǎng)的外植體；
A3)將所述恢復(fù)培養(yǎng)的外植體進(jìn)行分化培養(yǎng)得到抗性叢生芽；
A4)將所述抗性叢生芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到抗性幼芽；
A5)將所述抗性幼芽進(jìn)行培養(yǎng)得到所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株；
所述將所述抗性幼芽進(jìn)行培養(yǎng)得到所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株包括B1)、B2)和B3)：
B1)將所述抗性幼芽進(jìn)行生根培養(yǎng)得到抗性植株；
B2)將所述抗性植株的頂芽進(jìn)行二次生根培養(yǎng)得到根成放射狀生長(zhǎng)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株；
B3)將所述根成放射狀生長(zhǎng)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行二次分化培養(yǎng)得到所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述恢復(fù)培養(yǎng)為將所述共培養(yǎng)的外植體在恢復(fù)培養(yǎng)基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培養(yǎng)；所述恢復(fù)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固體培養(yǎng)基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的濃度分別為0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L；
所述增殖培養(yǎng)為將所述抗性叢生芽在增殖培養(yǎng)基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培養(yǎng)；所述增殖培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入卡那霉素和特美汀得到的固體培養(yǎng)基，其中所述特美汀的濃度為250mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述恢復(fù)培養(yǎng)的時(shí)間為5-10天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述將所述根成放射狀生長(zhǎng)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行二次分化培養(yǎng)得到所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株，包括D1)和D2)：
D1)將所述根成放射狀生長(zhǎng)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株的葉片進(jìn)行二次分化培養(yǎng)得到二次分化無(wú)根組培苗；
D2)將所述二次分化無(wú)根組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)得到所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化方法還包括將所述外源基因穩(wěn)定表達(dá)的楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行煉苗和移栽的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述楊樹(shù)為山新楊(Populus davidiana×P.bolleana)或歐美楊107(P.euramericana)或毛白楊(P.tomentosa)。
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