[發(fā)明專(zhuān)利]基于雜交連接法檢測(cè)非編碼RNA轉(zhuǎn)錄水平的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510018063.4
• 申請(qǐng)日: 2015-01-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104593496A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周征;曾珍;王丹;王子天;陳潤(rùn)生
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 長(zhǎng)沙朕揚(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌

1.一種基于雜交連接法檢測(cè)非編碼RNA轉(zhuǎn)錄水平的方法，包括以下步驟：

(1)經(jīng)提取、提純獲得含待檢測(cè)目標(biāo)ncRNA的樣本液；

(2)配制雜交反應(yīng)體系，使上述樣本液中的待檢測(cè)目標(biāo)ncRNA與兩個(gè)完全互補(bǔ)配對(duì)的DNA片段進(jìn)行雜交，形成ncRNA-oligos雜合鏈；

(3)配制連接反應(yīng)體系，用T4DNA連接酶對(duì)上述得到的ncRNA-oligos雜合鏈進(jìn)行缺口修復(fù)，得到含HL-DNA的待檢測(cè)樣本；

(4)以上述得到的含HL-DNA的待檢測(cè)樣本為模板，直接用于熒光定量PCR的檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析待檢測(cè)目標(biāo)ncRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的提取是采用Trizol法，具體包括以下操作：

(1.1)以特定目標(biāo)細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象，培養(yǎng)完成后吸除舊培養(yǎng)液，用預(yù)熱后的1×PBS清洗目標(biāo)細(xì)胞；

(1.2)使用細(xì)胞刮刀將目標(biāo)細(xì)胞刮下、收集，經(jīng)冷凍離心機(jī)離心處理；

(1.3)將離心處理后的上清液去除，加入Trizol，經(jīng)渦旋震蕩后，加入氯仿，繼續(xù)將其渦旋震蕩，室溫放置后自然分相；

(1.4)再經(jīng)冷凍離心機(jī)離心處理，此時(shí)樣品分為三層，取上層無(wú)色透明清液轉(zhuǎn)移至離心管中；

(1.5)在轉(zhuǎn)移后的無(wú)色透明清液中加入異丙醇，然后靜置，再離心處理；

(1.6)當(dāng)離心處理分層后，移除上清液，在剩余的白色沉淀中加入預(yù)冷的乙醇沖洗，震蕩清洗白色沉淀；

(1.7)繼續(xù)離心處理，去除上清液后干燥；

(1.8)最后加入RNase-free?H₂O溶解干燥后的沉淀，使其充分溶解，離心處理后轉(zhuǎn)移至EP管中保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的提純是采用DNase?I處理和抽提處理，具體包括以下操作：

(2.1)使用DNase?I處理經(jīng)提取后獲得的總RNA，反應(yīng)體系如下：按照一定的添加比例向總RNA中加入DNase?I和Reaction?Buffer，無(wú)菌水補(bǔ)足至最終體積，上下顛倒混勻，置于37℃反應(yīng)，然后加入一定量的EDTA，震蕩離心，65℃反應(yīng)一段時(shí)間；

(2.2)在經(jīng)過(guò)上述DNase?I處理后的總RNA中加入NaAc溶液，再加入氯仿/苯酚/異丙醇，渦旋震蕩，離心；取上層清液，再加入等體積的氯仿，渦旋震蕩，離心；取出上層清液，使用糖原沉淀RNA，稍加混勻后再加入無(wú)水乙醇略微震蕩混勻；于-80℃中放置超過(guò)15min，離心，棄上層清液，再加入乙醇溶液，震蕩，清洗沉淀，再離心處理后棄上層清液，室溫晾干沉淀，干燥后加入適量ddH₂O溶解沉淀。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的雜交反應(yīng)體系的配制方法包括：

配制組分：

上游片段，1μM，0.5μL；

下游片段，1μM，0.5μL；

10×雜交緩沖液，0.5μL；

提純后的總RNA，≤2.555μg，補(bǔ)加RNase-free?H₂O至5μL；

混勻后，按照以下條件進(jìn)行雜交反應(yīng)：95℃、5min，45℃、30min，然后立即取出冷卻至室溫。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述上游片段和下游片段的長(zhǎng)度范圍為50～59bp。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述雜交緩沖液中含100mM?PBS和1.5M?NaCl，雜交緩沖液的pH為7.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的連接反應(yīng)體系的配制方法包括：

配制組分：

步驟(2)雜交后的雜交產(chǎn)物，2μL；

5×Buffer，4μL；

T4DNA連接酶，1μL；

補(bǔ)加RNase-free?H₂O至20μL；

混勻后，按照以下條件進(jìn)行酶連反應(yīng)：25℃、2h，65℃、10min，冷卻至4℃；

最后將連接好的HL-DNA瞬間離心，可放于-20℃長(zhǎng)期保存。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的熒光定量PCR的擴(kuò)增程序包括：預(yù)變性95℃、5min，變性溫度95℃、10s，退火溫度55℃～57℃、30s，延伸溫度72℃、10s，循環(huán)次數(shù)40，緊接熔解曲線分析；檢測(cè)結(jié)束后，使用Bio-Rad?CFX?Manager進(jìn)行結(jié)果分析。