[發明專利]一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法

有效

• 申請號: 201510017280.1
• 申請日: 2015-01-13
• 公開（公告）號: CN104587457B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 李中圣;王貴平;李其昌;何永龍;喬晶鑫
• 申請（專利權）人: 廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K9/107
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 羅偉添

1.一種利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其特征在于依次包括如下步驟：

a.取溶解于生理鹽水或PBS緩沖液的抗原液，在相對離心力為7000-10000xg的條件下離心處理15min，收集沉淀物；

b.將經過a步驟得到的沉淀物用100～150倍體積(W︰V)的生理鹽水或PBS重懸，接著攪拌使沉淀物均勻分散；然后在相對離心力為7000-10000xg的條件下離心處理15min，收集沉淀物；將收集到的沉淀物用生理鹽水或PBS重復洗滌3次；

c.將經過b步驟得到的沉淀物在相對離心力為7000-10000xg的條件下離心處理15min，收集沉淀物；

d.接著將c步驟得到的沉淀物重懸于100～150倍體積(W︰V)的生理鹽水或PBS中；接著，進行冰浴超聲處理使沉淀物均勻分散，得到沉淀物懸液；

e.將d步驟獲得的沉淀物懸液加入無菌的低溫超高壓均質機/低溫納米級微生物破碎機的上樣容器中，在2～8℃、600～800bar的壓力下進行均質，收集第一穿出液；接著，將第一穿出液在2～8℃、1000～1200bar的壓力下進行制粒，重復兩次，得到，收集第二穿出液；

f.將e步驟收集到的第二穿出液用生理鹽水或PBS調整濃度到≥300μg/mL；

g.向經過f步驟處理得到的第二穿出液中加入佐劑，制得疫苗。

2.根據權利要求1所述的利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述e步驟中的制粒工藝制得的微粒的平均粒徑為20-200nm。

3.根據權利要求1所述的利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其特征在于所述a步驟中的抗原液通過如下方法獲得：將培養基中的工程菌進行酶解或機械裂解，離心，分別收集上清液和沉淀；將收集到的沉淀物重懸于100～150倍體積(W︰V)的的TNE-U緩沖液中，在超聲破碎儀中在200w的功率下冰浴超聲10-20min，使沉淀物均勻分散；接著加入體積為培養基體積1/100的TNE-U緩沖液，然后在溫度為4℃的層析柜中振蕩30min；接著離心收集沉淀，所述離心處理的相對離心力為7000xg、時間為15min；接著將收集到的沉淀重懸于體積為培養基體積1/100的TNE-T緩沖液中，超聲破碎儀中在200w的功率下冰浴超聲10-20min，使沉淀物均勻分散；接著加入體積為培養基體積1/100的TNE-T緩沖液，然后在溫度為4℃的層析柜中振蕩30min，得到抗原液；

所述TNE-U緩沖液由如下方法制成：將Tris-Base、NaCl、Urea和蒸餾水混合，然后經過0.45μm濾器過濾除菌處理，即得；其中Tris-Base的摩爾濃度為0.5mol/L、NaCl的摩爾濃度為0.25mol/L、Urea的摩爾濃度為2-4mol/L，所述TNE-U緩沖液的pH值為7.4；

所述TNE-T緩沖液由如下方法制成：取脫氧膽酸和Triton?X100的一種，然后與Tris-Base、NaCl和蒸餾水混合，然后經過0.45μm濾器過濾除菌處理，即得；其中Tris-Base的摩爾濃度為0.5mol/L、NaCl的摩爾濃度為0.25mol/L、TritonX100的體積百分數為0.1-1％、脫氧膽酸的質量百分數為5-10％，所述TNE-T緩沖液的pH值為7.4。

4.根據權利要求3所述的利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其特征在于：所述蛋白抗原為在生理溶液中溶解度較低的純化蛋白或重組表達后為包涵體形式的蛋白；所述多肽抗原為人工合成、提純后在生理溶液中難溶多肽或重組表達后不溶解的多肽物。

5.根據權利要求4所述的利用難溶或不溶蛋白、多肽抗原制備納米微粒疫苗的方法，其特征在于：

所述TNE-U緩沖液中Tris-Base的摩爾濃度為0.5mol/L、NaCl的摩爾濃度為0.25mol/L、Urea的摩爾濃度為2mol/L，所述TNE-U緩沖液pH值為7.4；

所述TNE-T緩沖液中Tris-Base的摩爾濃度為0.5mol/L、NaCl的摩爾濃度為0.25mol/L、Triton?X100的體積百分數為0.1-1％、脫氧膽酸的質量百分數為5-10％，所述TNE-T緩沖液pH值為7.4。