[發明專利]一種含自體脂肪干細胞的生物美容面膜的制備方法及其產品

在審

• 申請號: 201510014820.0
• 申請日: 2015-01-13
• 公開（公告）號: CN104622771A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 陳鎮洲;寇蕊;劉兵
• 申請（專利權）人: 廣州賽奕德生物技術有限公司
• 主分類號: A61K8/98
• 分類號: A61K8/98;A61K8/73;A61K8/02;A61Q19/08;A61Q19/00;A61P17/02;A61P17/10;A61P17/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種含自體脂肪干細胞的自體生物美容面膜的制備方法，其中，所述方法包括通過從自體脂肪中培養獲取自體脂肪干細胞，并從自體外周血中得到富含血小板的血漿；取瓊脂糖加入生理鹽水后加熱溶解，待溫度降至40℃加入富含血小板的血漿，混勻后加入自體脂肪干細胞從而制備成生物美容面膜；

其中，所述自體脂肪干細胞經流式細胞儀檢測，高表達CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表達CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述面膜中還添加營養因子。

3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，所述自體脂肪干細胞由腹部抽脂獲得脂肪組織液，用1×PBS沖洗5次，去除吸脂手術中所用藥物、油及血細胞；用質量體積比0.1％I型膠原酶37℃消化60分鐘，間隔10分鐘用1ml移液槍反復吹打；消化后1000轉每分鐘離心10分鐘，吸棄上層脂肪后，加入1×PBS混勻，用200目細胞篩過濾；所獲得的細胞懸液1000轉每分鐘離心10分鐘，細胞沉淀用1×PBS洗滌1次，加入含體積分數10％胎牛血清的α-MEM培養液重懸，苔盤蘭染色計數后按1-10×10⁶細胞/ml加入到25cm²的細胞培養瓶中，于37℃，5％CO₂培養箱中生長48小時；

培養48小時后對脂肪干細胞換液，用5ml移液管吸棄培養液，加入含體積分數10％胎牛血清的α-MEM培養液，25cm²培養瓶繼續放置37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養，間隔2天用新鮮培養液進行換液1次；

脂肪干細胞在25cm²培養瓶中生長融合達到80％以上，用5ml移液管吸棄培養液，取5ml1×PBS洗滌一次培養瓶底，加入0.5ml、質量體積比為0.25％胰酶到培養瓶中，放置37℃，5％CO₂培養箱中消化2-3分鐘；消化后加入200μl胎牛血清終止消化，再加入5ml的生理鹽水，用5ml移液管吹打，吸至15ml離心管中，再用5ml的生理鹽水洗滌一次，加入到同一個15ml離心管中，1000轉每分鐘離心5分鐘收集脂肪干細胞；離心后用1ml新鮮培養液重懸，計數，用5ml移液管加入10ml新鮮的含體積分數10％胎牛血清的α-MEM培養液，加入到1瓶75cm²培養瓶中繼續在37℃，5％CO₂培養箱中生長，每隔2天換一次新鮮培養液；待脂肪干細胞生長融合達到80％以上時，按上述經胰酶消化收集脂肪干細胞，連續傳代3代培養，獲得4×10⁷以上的脂肪干細胞，用4ml生理鹽水重懸，苔盤蘭染色計數，即獲得脂肪干細胞，放置冰箱4℃存放備用；

部分脂肪干細胞用40％脂肪干細胞培養液、10％二甲基亞砜和50％胎牛血清組成的凍存液，儲存在-196℃液氮罐中，以備今后復蘇后使用；

取苔盼蘭染色計數后的3×10⁶脂肪干細胞，分三組，第一組分別添加到有20μE?FITC標記鼠抗人CD29單抗、20μL?PE標記鼠抗人CD44單抗和20μL?Percp標記鼠抗人CD34單抗；第二組分別添加到有20μL?FITC標記鼠抗人CD45單抗、20μL?PE標記鼠抗人CD105單抗和20μL?Percp標記鼠抗人CD14單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20μL?FITC標記鼠IgG1、20μL?PE標記鼠IgG1和20μL?PerCP標記鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分鐘，然后用1mL的1×磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的1×PBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur臨床型流式細胞儀檢測；自體脂肪干細胞高表達CD29+≥90％、CD44+≥90％和CD105+≥90％，低表達CD34+≤10％、CD45+≤10％和CD14+≤10％。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶含質量體積比為0.01％的EDTA；所述PBS的pH值為7.4。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，自體血漿由抽取人50-100ml?EDTA抗凝外周血，經1000轉每分鐘離心10分鐘得到的10-80ml血漿，再次3000轉每分鐘離心10分鐘獲得10-80ml富含血小板血漿，放置4℃冰箱存放備用。