[發明專利]12種豬常見病毒及細菌免疫磁珠純化試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201510013217.0
• 申請日: 2015-01-12
• 公開（公告）號: CN105779398A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 王新杰;高姍姍;孫曉明;胡祥鈺
• 申請（專利權）人: 北京億森寶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12N1/20;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉細菌及病毒的生物技術檢測領域，特別是涉及一種采用免疫磁珠同時分離純 化12種豬常見病毒及細菌的試劑盒及方法。

背景技術

我國是農業畜牧業大國，豬類養殖以規?；s化養殖為主，高密度的養殖方式也使 得豬類的傳染性疾病難以預防，且問題日益顯著。而且多種病原同時感染，導致診斷及預防 疾病發生也十分困難。豬類常見的傳染性疾病病原有豬細小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、 豬鏈球菌II型(Streptococcussuistype2，SS-II)、豬偽狂犬病毒(Porcinepseudorabies virus，PRV)、豬圓環II型病毒(Porcinecircovirus-2，PCV-2)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirus，TEGV)、流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)、輪狀病 毒(Porcinerotavirus，PRTV)、豬流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)、豬瘟病毒(Classicalswine fevervirus，CSFV)、豬口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)、豬藍耳病毒(Porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、高致病豬藍耳病毒株(Highpathogenic porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，Hp-PRRSV)等。目前對豬細菌的分離純化 方法主要是采用挑菌、接種培養基平板的方法，該方法不僅費時，而且漏檢率高。病毒的分 離純化方法主要是使用細胞培養的方法，該方法對操作人員要求較高，且對實驗室環境及實 驗設備要求較高，且周期較長。

免疫磁珠分離技術(Immunomagneticbead-basedseparation)是近年來發展起來的一項 新的免疫學技術，可以有效捕獲樣品中的病原，去除復雜樣本中的抑制物，減少培養時間， 富集大量樣本中的靶目標。本發明免疫磁珠是以免疫學為基礎，將鏈霉素磁珠偶聯生物素化 的多種單克隆抗體，利用特異性的免疫學反應，在磁力作用下，發生力學移動，從混合溶液 中分離純化病原。免疫磁珠具有特異性好，敏感度高的特點，提高了分離純化的準確率，減 少假陽性的出現。

目前已有相關的研究針對不同病原菌或病毒利用免疫磁珠進行分離純化。例如，申請 號為CN201110349281.8公開了腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測方法，它采用免疫磁 珠對腐敗希瓦氏菌進行富集，并進行FQ-PCR檢測。申請號為CN200810198009.2公開了一 種輪狀病毒實時熒光PCR檢測試劑盒。申請號為CN201210062791.1公開了一種副溶血性弧 菌檢測試劑盒及其檢測方法。申請號為CN201410182398.5公開了一種空腸彎曲桿菌和沙門 氏菌的磁捕獲-雙重實時熒光PCR檢測方法。但對于使用免疫磁珠對多種病毒及細菌進行免 疫純化分離的研究較少，對于生物素化鏈霉素磁珠的分離純化條件沒有進行詳細的研究。本 發明利用免疫反應、生物素-鏈霉素偶聯及磁場動力效應，對12種豬常見病毒及細菌的進行 分離純化，可提高病原的富集濃度及檢測靈敏度。同時通過該方法的操作簡單，穩定性好， 耗時少的特點，可減少病原檢測時間。

發明內容

本發明的目的是提供一種12種豬常見病毒及細菌免疫磁珠純化試劑盒及方法，準確 性、特異性和敏感性高，穩定性好，能夠對12種病原進行快速分離純化。

具體的針對上述目的，本發明提供的技術方案如下：

(1)免疫磁珠的制備。

進一步的，所述步驟(1)具體包括以下步驟：

1)將12種單克隆抗體進行生物素化標記；

2)將步驟1)的12種生物素化的單克隆抗體偶聯鏈霉素磁珠(StreptavidinParticles Plus-DM)；

3)制備含有生物素化單克隆抗體包被的鏈霉素磁珠的反應體系；

進一步的，步驟1)中單克隆抗體終濃度為480ng/ml。

進一步的，步驟2)鏈霉素磁珠終濃度為20μg/ml，室溫下孵育30min。