[發明專利]一種用于MALDI?TOFMS檢測的植物線蟲前處理方法

有效

• 申請號: 201510012165.5
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104596816B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 龍海;李芳榮;李一農;凌杏園;馮建軍;鄭耘;謝泳桂;劉亮山
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/64
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司44223
• 代理人: 劉莉

技術領域

本發明屬于質譜分析技術領域，特別是涉及一種用于MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry的縮寫，中文全稱為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜)檢測的植物線蟲前處理方法。

背景技術

MALDI-TOF MS儀器主要由兩部分組成：基質輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。它是一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段。近年來，該技術逐漸被用于植物細菌、真菌和線蟲的檢測當中。但檢測前對植物線蟲的前處理方法很難操作，使得到的結果穩定性差、背景信號多而雜、靈敏度低從而影響對植物線蟲的檢測。

發明內容

為了彌補上述現有技術的不足，本發明提出一種用于MALDI-TOF MS檢測的植物線蟲前處理方法。

本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：

一種用于MALDI-TOF MS檢測的植物線蟲前處理方法，包括如下步驟：

(1)在滅菌的載片上滴加提取液，所述提取液的滴加量為每條所述植物線蟲滴加5-8μl；

(2)在體視顯微鏡下將清洗好的所述植物線蟲轉移到所述載片上的提取液中，并壓破所述植物線蟲，所述提取液用于提取所述植物線蟲的蛋白質并將所述蛋白質降解為多肽；

(3)在體視顯微鏡下，用移液槍吸取步驟(2)中的提取液并連帶壓破的植物線蟲一起滴加在樣品板上，并晾干；

(4)在晾干后的樣品板上加基質溶液，使所述多肽分散在所述基質溶液中，并晾干得到用于MALDI-TOF MS檢測的樣品，每條所述植物線蟲加1-1.5μl的所述基質溶液。

優選地，所述提取液選自以下群組中的一種：

三氟乙酸和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，三氟乙酸的體積濃度為0.1-0.5％，余量為滅菌水；

乙醇和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，乙醇的體積濃度為90-95％，余量為滅菌水；

丙酮和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中，丙酮的體積濃度為90-95％，余量為滅菌水；

甲酸、乙腈和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中所述甲酸的體積濃度為33-37％，所述乙腈的體積濃度是48-52％，余量為滅菌水；

甲酸、異丙醇和滅菌水的混合溶液，在該混合溶液中所述甲酸的體積濃度為17-22％，所述異丙醇的體積濃度是33-35％，余量為滅菌水。

優選地，步驟(4)中的所述基質溶液是由以下形成：將適用于多肽的基質加入一溶劑中直到所述基質過飽和。

進一步優選地，所述基質為α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid,CHCA)、芥子酸(sinapinic acid)、阿魏酸(Ferulic Acid)、2-(4-羥基亞胺)苯甲酸(2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid,HABA)、5-氯-2-巰基苯丙噻唑(5-chloro-2-mercaptobenzothiazo1e,CMBT)。

進一步優選地，所述溶劑選自以下群組中的一種：

乙腈、三氟乙酸和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙腈的體積濃度為33-50％，三氟乙酸的體積濃度為2.5-3.3％，余量為滅菌水；

乙醇和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙醇的體積濃度為45-55％，余量為滅菌水；

甲醇和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中甲醇的體積濃度為45-55％，余量為滅菌水；

乙腈和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中乙腈的體積濃度為45-55％，余量為滅菌水；

四氫呋喃和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中四氫呋喃的體積濃度為45-55％，余量為滅菌水；

丙酮和滅菌水的混合溶劑，在該混合溶劑中丙酮的體積濃度為45-55％，余量為滅菌水。