[發(fā)明專利]一種人EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510011386.0
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104498616A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴立忠;吳康;龍鳳英;高堂杰
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙七合源專利代理事務(wù)所(普通合伙) 43214
• 代理人: 歐穎;吳婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種人EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒。

背景技術(shù)

EGFR(epidermal?growth?factor?receptor)即表皮生長因子受體，是一種跨膜受體酪氨酸激酶，正常情況下包埋在細(xì)胞表面的細(xì)胞膜中，是一種對腫瘤細(xì)胞的繁殖、生長、修復(fù)和存活等起重要作用的膜蛋白。一般認(rèn)為該酪氨酸激酶區(qū)域的激活即磷酸化對癌細(xì)胞增殖、生長的相關(guān)信號傳遞很重要。基于這個(gè)觀點(diǎn)，EGFR作為癌癥治療的分子靶標(biāo)受到普遍關(guān)注，并陸續(xù)開發(fā)出了EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和抗EGFR抗體等。

異常的EGFR活化能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化、血管新生，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。異常的EGFR活化機(jī)制包括受體本身的擴(kuò)增、受體配體的過表達(dá)、活化突變以及負(fù)性調(diào)節(jié)途徑的缺乏。EGFR誘導(dǎo)癌癥至少通過3種機(jī)制：EGFR配體的過表達(dá)、EGFR的擴(kuò)增或EGFR的突變活化。其中以EGFR的突變活化為主要機(jī)制。各項(xiàng)研究也表明EGFR在多種腫瘤細(xì)胞中存在突變或擴(kuò)增的情況。已經(jīng)檢測到的突變數(shù)量最多的是非小細(xì)胞肺癌。

在癌癥治療中，傳統(tǒng)的化療和放療由于缺乏特異性，取得療效的同時(shí)也往往給患者帶來較大的毒副作用。因此，選擇特異的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療日益受到人們的重視。在取得明顯療效的同時(shí)，又可以避免對正常細(xì)胞的傷害。EGFR是目前國內(nèi)外研究者公認(rèn)的一個(gè)腫瘤靶向治療分子。目前靶向EGFR的藥物主要有兩類：一類是作用與EGFR胞外區(qū)的單克隆抗體，這類抗體能與EGFR胞外配體結(jié)合部位結(jié)合，阻斷了EGFR其與配體的結(jié)合，從而阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；一類是作用與胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)域的小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine?kinase?inhibitor，TKI)，如gefitinib和erlotinib。酪氨酸激酶抑制劑主要為小分子喹啉類化合物，能夠與細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上ATP位點(diǎn)競爭性結(jié)合，可逆性、選擇性抑制EGFR相關(guān)的酪氨酸激酶活性及細(xì)胞內(nèi)磷酸化過程，進(jìn)而抑制EGFR下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻斷EGFR誘導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞的生長，加速細(xì)胞凋亡、拮抗血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、阻斷腫瘤生長。

目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的作用于EGFR的靶向藥物包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，例如吉非替尼(易瑞沙，阿斯利康制造)和厄洛替尼(特羅凱，羅氏制造)。臨床應(yīng)用表明，EGFR-TKI僅對部分病人有效，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因外顯子18，19，21突變是EGFR-TKI靶向藥物起作用的前提條件；而外顯子20Ins/T790M突變是造成繼發(fā)耐藥的主要原因。因此，專家推薦在使用EGFR-TKI靶向藥物之前進(jìn)行EGFR基因外顯子20的突變檢測有助于提高用藥的針對性，避免不必要的損失。

隨著人類醫(yī)學(xué)和藥物研究水平的提高，藥理遺傳學(xué)(Pharmacogenetics)日漸興起。研究表明，藥物在體內(nèi)的代謝、藥物治療的有效性以及副反應(yīng)、甚至患者的預(yù)后都存在個(gè)體差異，受患者基因背景的影響。因此，應(yīng)用藥理遺傳學(xué)，在基因水平上研究藥物作用的個(gè)體差異，使得個(gè)性化治療這一新一代醫(yī)學(xué)概念成為可能。對藥物作用相關(guān)基因的檢測，可指導(dǎo)醫(yī)生對患者準(zhǔn)確施藥，規(guī)避藥物副作用，同時(shí)提高病人乃至社會(huì)的醫(yī)療費(fèi)用效率。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)方法應(yīng)用于檢測人EGFR基因突變，主要包括測序、基因芯片、探針雜交技術(shù)等。而隨著FQ-PCR技術(shù)的發(fā)展，其在人EGFR基因突變診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越廣泛，也越來越為人所重視，人EGFR基因突變的實(shí)驗(yàn)診斷中，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性。

而基于熒光PCR技術(shù)與等位基因特異性PCR技術(shù)(ARMS-PCR)結(jié)合檢測人EGFR基因突變的方法被越來越多的研發(fā)人員嘗試使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結(jié)果。等位基因特異PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3→5外切酶活性，在一定條件下PCR引物3末端的錯(cuò)配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊锟梢酝ㄟ^PCR方法直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。