[發明專利]蕓薹屬栽培種細胞質的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201510010571.8
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104789650B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 向陽;杜才富;張敏琴;張星星;王大紅;韓宏仕;李大雄;張濤
• 申請（專利權）人: 貴州禾睦福種子有限公司;貴州省油菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;A01H1/04
• 代理公司: 上海大視知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 31314
• 代理人: 顧小偉

1.區分蕓薹屬栽培種細胞質的分子檢測方法，其特征在于：對蕓薹屬栽培種的線粒體和葉綠體DNA為模板，用以下13對特異引物對ccmp2、trnL-F、rpl16、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB-PsbT、BnTR1、BnTR4進行擴增，所述蕓薹屬栽培種包括白菜、甘藍、黑芥、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥，其中：

第一對引物序列為：

正向引物5’-GATCCCGGACGTAATCCTG-3’

反向引物5’-ATCGTACCGAGGGTTCGAAT-3’

第二對引物序列為：

正向引物5’-TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAG-3’

反向引物5’-CAATTCAATATGGTTATATATTAGAG-3’

第三對引物序列為：

正向引物5’-GGTTCCGTCGTTCCCATCGC-3’

反向引物5’-CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC-3’

第四對引物序列為：

正向引物5’-AATGGTATGACTAGCTTATAAGG-3’

反向引物5’-CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3’

第五對引物序列為：

正向引物5’-GAAAAATGCAAGCACGGTTT-3’

反向引物5’-TACGATCCGTAGTGGGTTGC-3’

第六對引物序列為：

正向引物5’-TACCCGTATTAGGCACTA-3’

反向引物5’-TTTGTAAGACCACGACTG-3’

第七對引物序列為：

正向引物5’-ATTGGCTTACTTCTTGCG-3’

反向引物5’-GGTTTCCGGGATGTTATT-3’

第八對引物序列為：

正向引物5’-GGTTCGTTAGCAGGTTTA-3’

反向引物5’-GTTCCCTAGCAACACTTT-3’

第九對引物序列為：

正向引物5’-TGTACTTATGGGAAAGCG-3’

反向引物5’-CTGGGTTCTTCTACTTCATT-3’

第十對引物序列為：

正向引物5’-GGCCATAGGCTGGAAAGTCT-3’

反向引物5’-GTTTATGCATGGCGAAAAGG-3’

第十一對引物序列為：

正向引物5’-CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC-3’

反向引物5’-TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA-3’

第十二對引物序列為：

正向引物5’-CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCG-3’

反向引物5’-ACATAATGGCAATGTATCGGACTG-3’

第十三對引物序列為：

正向引物5’-GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC-3’

反向引物5’-AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT-3’，

用其線粒體和葉綠體目標基因的特異性引物進行PCR擴增，將PCR的電泳檢測結果進行數字化處理，用遺傳分析軟件進行分析，根據植物材料間的遺傳距離聚類結果，區分來自不同栽培種的細胞質。

2.根據權利要求1所述的區分蕓薹屬栽培種細胞質的分子檢測方法，其特征在于：所述PCR的反應體系如下：

PCR反應體系為10μL，包含20ng模板，正向引物和反向引物各0.25μmol/L，1x Taqbuffer，MgCl₂1.5mmol/L，每種dNTP 0.2mmol/L，0.5U的Taq DNA聚合酶，然后用ddH₂O補足10ul；采用Touch down擴增程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個循環，每個循環退火溫度降低0.5℃；94℃變性1min，57℃退火30s，72℃延伸45s，28個循環；72℃延伸10min；通過PCR擴增，分別獲得100-400bp的片段。

3.如權利要求1-2任一項所述的區分蕓薹屬栽培種細胞質的分子檢測方法在油菜雜交選育中的應用。