[發(fā)明專利]一種腫大細胞病毒DNA疫苗

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510010427.4
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104623689A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設計）人: 孫黎;張健;胡永華
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學及免疫學領域，具體的說是一種腫大細胞病毒DNA疫苗。

背景技術

虹彩病毒是一種大型、二十面體雙鏈DNA病毒。虹彩病毒科包含5個屬，腫大細胞病毒(Megalocytivirus)屬是其中的一個。腫大細胞病毒是危害嚴重的魚類病原，能夠感染多種硬骨魚類，包括我國重要養(yǎng)殖魚種如大菱鲆、鱖魚、石斑魚、真鯛等。目前腫大細胞病毒病的防治尚無有效措施。高等動物疫病防控研究表明，DNA疫苗能引起強性細胞免疫，因而是預防病毒病的有效手段之一。另外，DNA疫苗具有高穩(wěn)定性、無毒性等特點，是一種理想的疫苗形式。針對腫大細胞病毒的實驗室階段的候選疫苗已有報道，但是這些疫苗的生產(chǎn)應用性尚待確定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種腫大細胞病毒DNA疫苗及其應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種腫大細胞病毒DNA疫苗,以腫大細胞病毒RBIV-C1為模板，采用F1和R1為引物進行PCR擴增病毒基因ORF75，即得DNA疫苗質(zhì)粒。

進一步的說，以腫大細胞病毒RBIV-C1為模板，采用F1和R1為引物進行PCR擴增病毒基因ORF75，獲得質(zhì)粒pBS444；

將質(zhì)粒pCN3和質(zhì)粒pBS444分別酶切獲得的片段用T4DNA連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即得到DNA疫苗質(zhì)粒。

所述引物F?1為5'-GATATCATGGATGAGTACAATGCAGAGGGCT-3'；R1為5'-GATATCACACATGCCCATGTCAACAT-3'；

所述DNA疫苗質(zhì)粒在制備預防腫大細胞病毒中DNA疫苗的應用。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.高保護率。本發(fā)明的疫苗的免疫保護效率高達80％。

2.安全。本發(fā)明的疫苗沒有任何細胞毒性。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。

在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法：

1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。

2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook?and?Russel?l:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press?2001)；

3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術有限公司”。

實施例1：腫大細胞病毒DNA疫苗的構建。

步驟1)DNA疫苗pCN75的構建以及疫苗制備液的制備：

以已報導的腫大細胞病毒RBIV-C1(Zhang?M,Xiao?Z,Hu?Y,Sun?L.Characterizat?ion?of?a?megalocyt?ivirus?from?cultured?rock?bream,Oplegnathus?fasciatus(Temminck&Schlege),in?China.Aquac?Res.2012；43:556–64。)為模板，采用F1和R1為引物進行PCR擴增病毒基因ORF75(Zhang?B,Zhang?M,Sun?B,Fang?Y,Xiao?Z,Sun?L.Complete?genome?sequence?and?transcript?ion?profiles?of?the?rock?bream?iridovirus?RBIV-C1.Dis?Aquat?Org.2013；104:203-14.),PCR條件為：94℃?60s預變性模板DNA,然后94℃?40s,58℃?60s,72℃?90s,25個循環(huán)后再在72℃延伸反應10min，PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室溫連接2－4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)、40μg/ml?5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(X-gal)和24μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18－24小時，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBS444。