[發明專利]重組人CC16基因、其真核表達載體的構建及重組蛋白的純化

在審

• 申請號: 201510010331.8
• 申請日: 2015-01-08
• 公開（公告）號: CN104611340A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 龐敏;王海龍;袁麗榮;張新日;胡曉蕓;杜永成
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C07K14/47;C07K1/22
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所 14108
• 代理人: 李毅

1.一種重組人CC16基因，具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2.一種含有權利要求1所述重組人CC16基因的真核表達重組質粒，是以Xho?I和EcoR?I雙酶切的重組人CC16基因與真核表達載體pMSVpuro連接構成，具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

3.含有權利要求2所述真核表達重組質粒的真核細胞表達系統，是將所述真核表達重組質粒轉入HEK?293T?細胞中構建。

4.一種在HEK?293T?細胞表達體系中生產重組人CC16蛋白的方法，包括以下步驟：

1)?根據人CC16蛋白質對應的核苷酸序列，合成權利要求1所述的重組人CC16基因；

2)?將重組人CC16基因連接到真核表達載體pMSVpuro中，構建含有所述重組人CC16基因的真核表達重組質粒pMSCVpuro-hCC16；

3)?以所述真核表達重組質粒pMSCVpuro-hCC16轉染HEK?293T細胞，構建含有重組人CC16基因的HEK?293T?穩定細胞表達系統；

4)?在所述HEK?293T穩定細胞表達系統中，無血清培養基體系下培養表達重組人CC16蛋白；

5)?分離并純化所述重組人CC16蛋白；

其中，所述步驟2)中的真核表達載體pMSCVpuro經Xho?I和EcoR?I雙酶切后與同樣雙酶切的重組人CC16基因連接。

5.根據權利要求4所述的生產重組人CC16蛋白的方法，其中所述的HEK?293T?細胞在含有10%新生牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中，37℃和5%CO₂條件下生長，3～4天換液一次。

6.根據權利要求4所述的生產重組人CC16蛋白的方法，其中所述步驟3)中，在轉染24小時后加入終濃度為1.5μg/ml的嘌呤霉素，細胞培養48小時，以篩選出穩定表達人CC16蛋白的細胞克隆。

7.根據權利要求4所述的生產重組人CC16蛋白的方法，其中步驟5)所述重組人CC16蛋白的分離并純化過程為：

收集步驟4)無血清培養基上清；

剩余細胞用PBS洗滌，得到穩定轉染pMSCVpuro-hCC16的細胞，以蛋白裂解液孵育30min，收集細胞裂解液；

將收集的細胞裂解液與無血清培養液離心，收集上清，4℃下加入預先用TBS平衡的ANTI-FLAG?M₂親和凝膠中，使蛋白與凝膠孵育過夜；

以TBS洗掉親和凝膠上的未結合蛋白后，再用洗脫液洗脫親和凝膠上結合的目的蛋白，洗脫液中加入0.5M?Tris?HCl，pH7.4；1.5M?NaCl，使用截留分子量3kDa的濃縮管濃縮目的蛋白，得到純化的重組人CC16蛋白；

其中，所述的蛋白裂解液含有50mM?Tris-HCl，pH7.4；150mM?NaCl；1mM?EDTA；1%TRITON?X-100；所述TBS含有50mM?Tris?HCl，150mM?NaCl，pH7.4；所述洗脫液為0.1M甘氨酸-HCl，pH3.5。