[發(fā)明專利]聚焦離子束法制備冷凍含水切片的樣品夾持工具和轉移盒子

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510010319.7
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104568565B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 張建國;季剛;徐偉;孫飛
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: G01N1/42
• 分類號: G01N1/42;G01N1/04
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發(fā)明涉及冷凍電鏡電子斷層成像技術樣品制備和原位透射電鏡樣品制備領域。

背景技術

低溫電子斷層成像三維重構(cryo-ET)技術是發(fā)展結構生物學和細胞生物學研究的重要技術。該技術可以得到更真實和接近天然的細胞內部高分辨率三維結構以及蛋白質大分子定位及相互作用的信息，是蛋白質組學研究的重要的輔助手段。通常使用的樣品制備方法---冷凍切片技術，存在諸多問題，如切片和收集過程中樣品的壓縮、振顫、皺縮、斷裂以及載網(wǎng)附著能力差等，這些缺陷嚴重影響了該研究領域的發(fā)展。近年來一種新的冷凍含水切片樣品的制備方法-聚焦離子束法(focused ion beam-FIB)制備冷凍含水切片，是采用Ga離子與材料的原子碰撞發(fā)生濺射作用，以達到對樣品剪薄的作用，主要使用的設備是雙束掃描電鏡(裝有電子槍和離子槍并呈大約52°的夾角)和冷凍制備系統(tǒng)。在2006年最早由美國的M.Marko的研究組證明這種方法可行性，在2010年德國的W.Baumeister課題組和2012年美國的P.Zhang課題組對這些技術進一步發(fā)展和應用。冷凍含水切片樣品制備過程中，樣品夾持工具和傳輸工具是保證該技術順利進行，以及得到平整、厚度合適和低污染冷凍切片樣品的必須實驗設備。以上課題組的研究中使用的夾持和傳輸裝置都是根據(jù)本課題組特殊的透射電鏡自行研制的，載網(wǎng)容易損壞，不具有廣泛應用性質。現(xiàn)在市場上沒有相關的產品。

發(fā)明內容

本發(fā)明設計出一套使用方便、通用性強的樣品夾持工具和轉移盒子，可以直接夾持普通的透射電鏡載網(wǎng)(銅網(wǎng)或鉬網(wǎng))或特殊的透射電鏡載網(wǎng)(如FEI公司的Titan Krois透射電鏡特制的載網(wǎng)c-ring+c-clip)，并且對制備出的切片樣品進行方便的轉移和儲存。

本發(fā)明的一個方面提供一種設備，所述設備包括樣品夾持工具和樣品轉移盒子。

樣品夾持工具由高導熱純銅(紫銅)制成，其包括頂蓋、工具主體、圓柱底座、載網(wǎng)支撐凹槽和彈簧壓片。

頂蓋可以自由開關，并且可以完全覆蓋樣品夾持工具頂部(包括載網(wǎng)支撐凹槽和彈簧壓片)。

圓柱底座位于夾持工具底部，其直徑大小可以調節(jié)，可以與不同型號的冷凍傳輸設備的穿梭工具(shuttle)相連。

載網(wǎng)支撐凹槽的尺寸也可以根據(jù)所加載的載網(wǎng)的大小和形狀不同而變化。

凹槽預傾38°的夾角，目的是與雙束掃描電鏡中聚焦離子束(FIB)相平行，方便微加工操作。

樣品轉移盒子，外部由絕緣材料聚苯乙烯構成，內部由不銹鋼制成，包括電鏡載網(wǎng)存儲裝置放置槽、鏤空平臺、樣品夾持工具放置槽、樣品轉移盒子支架和轉移盒子外殼。

樣品轉移盒子具有一個或多個電鏡載網(wǎng)存儲裝置放置槽，其用于放置電鏡載網(wǎng)存儲裝置。在一個實施方案中，轉移盒子具有三個電鏡載網(wǎng)存儲裝置放置槽，可以放置三個電鏡載網(wǎng)存儲裝置，所述電鏡載網(wǎng)存儲裝置可以放置4個載網(wǎng)，因此在轉移盒子內一共可以裝置3×4＝12個載網(wǎng)樣品，液氮環(huán)境下方便實驗中載網(wǎng)存儲裝置的開關操作。

樣品夾持工具放置槽用于固定所述樣品夾持工具，其使得整個裝置能更加穩(wěn)定地裝卸載網(wǎng)。

鏤空平臺和支架可以使部分液氮流入樣品盒底部，使整個裝置長時間保持在低溫環(huán)境下，并且使整套裝置穩(wěn)固，方便實驗的進行。

本發(fā)明有如下創(chuàng)新點：

1.保持低溫

本發(fā)明采用紫銅金屬塊作為樣品夾持工具的材料，通過熱傳導作用可以將加工過程中產生的熱量及時傳導出去，使冷凍樣品的載網(wǎng)持續(xù)保持在液氮溫度。

2.減少樣品的污染

本發(fā)明的樣品夾持工具上帶有開關緊密的防污染蓋子，只有在切割過程中打開，可以保證在傳輸和轉移過程中減少樣品與外界的接觸，防止冰晶污染。

3.方便的轉移盒子

本發(fā)明研發(fā)一套低溫樣品的夾持，在傳輸工具中可以方便的在液氮環(huán)境中將載網(wǎng)夾載在樣品夾持工具中，以及將制備好的冷凍含水切片樣品從夾持工具中取出并儲存好。

使用本發(fā)明設計的樣品夾具和傳輸工具，可以有效簡化實用操作，同時也可以明顯的減少冷凍含水切片在制備和傳輸過程中的冰污染，從而獲得到更大面積的切片可觀察區(qū)域，實驗操作簡單，應用廣泛。

更具體地，本發(fā)明提供以下各項：

1.用于轉移和儲存電鏡載網(wǎng)的設備，所述設備包括樣品夾持工具和樣品轉移盒子，其中