[發(fā)明專利]一段特異性調(diào)控逆境條件下植物蛋白穩(wěn)定性的多肽序列及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510010018.4
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104498467A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王寧寧;熊莉;孫立方;王丹
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體說是用分子生物學(xué)技術(shù)將一段多肽與目的蛋白融合從而調(diào)控目的蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平，使其僅在各種逆境脅迫條件下特異性積累、但在植株正常旺盛生長時被降解，從而保證轉(zhuǎn)基因植物既能正常生長發(fā)育又能具有較強(qiáng)逆境抗性，以及該肽段在科學(xué)研究與基因工程技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國是一個以農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)的國家，但是隨著人口的逐年增長、耕地面積的不斷減少和農(nóng)業(yè)可利用資源的日趨緊張，糧食供給面臨著巨大挑戰(zhàn)。提高和穩(wěn)定糧食產(chǎn)量已成為我國當(dāng)前國家重大戰(zhàn)略發(fā)展的需求（周建軍等，2014）。同時，隨著生活水平的提高，人們對品味、口感、營養(yǎng)價值和欣賞價值等品質(zhì)性狀也越來越關(guān)注，迫使植物育種工作者在提高作物產(chǎn)量的同時培育富含營養(yǎng)（特別是一些特定蛋白質(zhì)和氨基酸）、品質(zhì)優(yōu)良的作物新品種。為了解決這些問題，大量生物技術(shù)被逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)并且發(fā)揮越來越重要的作用，如植物基因工程、組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程等技術(shù)。

植物基因工程技術(shù)是利用重組DNA技術(shù)，有計劃地在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物基因進(jìn)行改造和重新組合，然后再插入、整合到事先準(zhǔn)備好的受體植物基因組中，使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，從而使受體植物獲得新的性狀，培育出高產(chǎn)、多抗和優(yōu)質(zhì)的新品種（候文邦等，2005）。利用植物基因工程技術(shù)可以更方便地對更多基因進(jìn)行有目的的操作，打破自然界物種間難以交配的天然屏障，將不同物種的基因按人們的意志重新組合，拓寬了植物可利用的基因庫，為創(chuàng)造新種質(zhì)資源、培育植物新品種開辟了新的技術(shù)路線。自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草、馬鈴薯以來，植物基因工程的研究和開發(fā)進(jìn)展十分迅速。截止1997年，全球大約進(jìn)行了25000次轉(zhuǎn)基因作物的田間試驗，涉及10個國家、60種作物、10個性狀（成寶珍等，2014）。目前，已育成了一大批耐除草劑、抗病、抗蟲、抗逆的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物新品種，并開始在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用（候文邦等，2005）。

近年來發(fā)現(xiàn)的大量具有應(yīng)用價值的潛力基因，例如擬南芥中關(guān)鍵的逆境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子DREB1A（Kasuga等，1999）和CBFs（Hsieh等，2002a；Hsieh等，2002b）等，它們在轉(zhuǎn)基因植物中組成型過表達(dá)后可以獲得預(yù)期的優(yōu)良表型，如增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對特定脅迫的抗逆性、延緩植株的衰老等，但是往往伴隨著影響植株在合適生長條件下的正常生長和發(fā)育，導(dǎo)致植株矮小、生長遲緩或產(chǎn)量下降等。如果可以特異性地表達(dá)這些基因，讓它們在特定的發(fā)育階段或脅迫條件下高表達(dá)，而在正常的生長過程中維持在較低的基礎(chǔ)水平，可以大大提高它們在基因工程中的應(yīng)用性。對此，人們通常習(xí)慣使用組織特異性啟動子驅(qū)動目的基因的表達(dá)來實現(xiàn)這一目標(biāo)（Kasuga等，1999；Lee等，2003；Kasuga等，2004；Kovalchuk等，2013；Li等，2013；Wang等，2013）。但是，這一方法也有其局限性。首先，目前為止分離獲得和應(yīng)用的組織特異性啟動子還比較少，并且伴隨著活性低、組織特異性不高的缺點。啟動子活性過低會限制目的基因的表達(dá)，導(dǎo)致其無法達(dá)到發(fā)揮功能所需要的水平；其次，一般來說，具有育種潛力的基因在整合到受體植物基因組中以后，需要轉(zhuǎn)錄翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)來發(fā)揮調(diào)控植物生長發(fā)育的功能，而基因表達(dá)調(diào)控需要轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個層次的控制。轉(zhuǎn)錄后/翻譯后水平的調(diào)控對多數(shù)基因的功能發(fā)揮起重要作用，有時僅僅利用特異性啟動子很難達(dá)到滿意的效果。而通過在蛋白水平上調(diào)控目的基因的表達(dá)能夠很好地彌補(bǔ)這些缺陷，具有很大的應(yīng)用潛力。

最近，Jang等人發(fā)現(xiàn)擬南芥RAD23a蛋白的泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域1（UBA1）和UBA2作為穩(wěn)定信號可以顯著地增強(qiáng)兩種短命的轉(zhuǎn)錄因子HFR1和PIF3的穩(wěn)定性，從而使轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)現(xiàn)出比單純過表達(dá)這兩個轉(zhuǎn)錄因子的植株更強(qiáng)的表型。擬南芥DDI1蛋白的UBA結(jié)構(gòu)域也可以延長茉莉酸信號路徑上的短命蛋白JAZ10.1的半衰期。他們指出可以根據(jù)UBA結(jié)構(gòu)域的特性將它與植物中其他短命蛋白融合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，用于對這些蛋白功能的基礎(chǔ)性研究以及作物的改良（Jang等，2012）。由此可見，獲得可以在蛋白水平特異調(diào)控基因表達(dá)的多肽，將其與目的蛋白融合，從而促使其在特定的發(fā)育階段或特定的環(huán)境脅迫條件下積累，而在其他情況下維持低水平，不僅有助于闡明某些植物蛋白的生物學(xué)功能等基礎(chǔ)理論問題，更可以有目的地控制轉(zhuǎn)基因植物中育種潛力基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育、提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和改善其品質(zhì)。目前已分離鑒定的這類特殊多肽（或肽段）及其應(yīng)用技術(shù)還相對較少，但是這一方法勢必將成為農(nóng)作物性狀改良與新品種培育的新的強(qiáng)有力工具，具有廣泛的應(yīng)用價值。