[發明專利]用于識別結締組織生長因子的核酸適配子及其應用

有效

• 申請號: 201510002986.0
• 申請日: 2015-01-05
• 公開（公告）號: CN104745587B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 郝志明;李爽;張倩楠;呂頤菲;霍涌瑋;田宏
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 徐文權

技術領域

本發明屬于蛋白質檢測技術領域，具體涉及一組用于識別結締組織生長因子的核酸適配子及其應用。

背景技術

結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)，是新近發現的一種強力的促進肝纖維化因子，在肝纖維化發生發展過程中起著中心作用。CTGF是分泌型蛋白，是高度保守的CCN家族成員之一，具有促進細胞增殖，促進細胞外基質沉積，介導細胞粘附，刺激細胞遷移，促進軟骨形成及骨骼發育等多種生物學作用。CTGF在肝纖維化肝組織中表達上調，其表達水平與肝纖維化程度正相關。

指數富集式配體系統進化技術(SELEX)技術是90年代建立的一項篩選技術，基本思想是：體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，由于每個不同序列的單鏈核酸可以自身折疊形成特異的二級結構，不同二級結構的單鏈核酸就有可能與不同靶分子或一個靶分子中的不同位點依照熱力學原理結合，從而篩選出與靶分子結合的短鏈核酸即特異的適配子。基本過程為，將隨機寡核苷酸文庫與靶物質混合，使靶物質與核酸結合，然后洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下一輪的篩選過程。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而與靶物質高有親和力的DNA分子或RNA分子從非常大的隨機庫中分離出來，且純度隨過程的進行而增高，最后占據產物的大多數，稱之為適配子。核酸適配子在親和力和特異性方面可與抗體媲美，甚至優于抗體，并且具有抗體所不具備的其他一些優點：①靶分子范圍更廣，幾乎沒有任何限制。目前篩選適配子的靶分子包括金屬離子、小分子化合物、糖類、核酸、堿基類似物、多肽與蛋白質、甚至完整的病毒顆粒、致病菌和活細胞等等。②適配子通過體外篩選，不依靠動物、細胞及內環境，毒素和毒素結合位點也可作為靶標；③適配子篩選周期更短，篩選過程已經自動化，能應用于大規模的工業生產；④適配子穩定性好,可長期保存,能在常溫下運輸；⑤化學合成的適配子精確度高，重復性強，生產中很少存在批次間的差異；⑥結合能力強。甚至強于天然配基,解離常數(K_d)多在pmol/L－nmol/L之間；⑦適配子沒有免疫原性，沒有毒性和明顯的副作用。可用于體內診斷或治療；⑧報告子如熒光素或生物素等可與適配子精確地結合在操作者能識別的位點上；⑧結合特異性強。通過反向SELEX篩選，可以有效減弱以至消除既與靶分子結合、又與靶分子類似物結合的核酸分子，從而篩選出高度特異結合靶分子的適配子。適配子能夠分辨出靶分子結構上細微的差別，甚至可以區分1個甲基或1個羥基的差別。核苷酸、氨基酸的適配子能將它們與突變體、鏡像體區分開來。⑨便于修飾。可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶等。

發明內容

本發明的目的在于提供一組用于識別結締組織生長因子的核酸適配子及其應用。

本發明是通過以下技術方案來實現：

用于識別結締組織生長因子的核酸適配子，所述核酸適配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示。

在所述核酸適配子的核苷酸的5′端或3′端帶有生物素標簽。

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的核酸適配子命名為C-ap11，其結構為：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的核酸適配子命名為C-ap12，其結構為：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的核酸適配子命名為C-ap14，其結構為：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的核酸適配子命名為C-ap15，其結構為：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的核酸適配子命名為C-ap17p，其結構為：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示的核酸適配子命名為C-ap18，其結構為：

所述核酸適配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18特異性識別CTGF全長及C末端氨基酸片段。

所述核酸適配子C-ap17P特異性識別CTGF全長及N末端氨基酸片段。