[發明專利]卡貝縮宮素的合成工藝

在審

• 申請號: 201510001735.0
• 申請日: 2015-01-05
• 公開（公告）號: CN104592362A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 夏丹;徐盼;陳逸民;高魯;孫鋒;王良友
• 申請（專利權）人: 蘇州天馬醫藥集團天吉生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K7/16
• 分類號: C07K7/16;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 馬明渡;王健

1.?一種卡貝縮宮素的合成工藝，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、以AM?Resin為起始載體，在縮合試1-羥基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二異丙基碳二亞胺（DIC）的作用下，偶聯Rink?Amide-AM?Linker，制得Rink?Amide-AM?Resin，此Rink?Amide-AM?Resin替代度為sub=0.7~0.8?mmol/g；

步驟二、采用固相多肽逐步縮合法，根據肽序從C端至N端，首先將Fmoc-Gly-OH與步驟一Rink?Amide-AM?Resin偶聯反應獲得Fmoc-Gly-Rink?Amide-AM?Resin；

步驟三、去除步驟二Fmoc-Gly-Rink?Amide-AM?Resin的保護基Fmoc，從而獲得H-Gly-Rink?Amide-AM?Resin；

步驟四、采用固相多肽逐步縮合法逐步依次完成H-Gly-Rink?Amide-AM?Resin與Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH的偶聯，合成卡貝縮宮素的前體肽Fmoc-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM?Resin；

步驟五、DBLK（20%哌啶/DMF混合溶液）去除卡貝縮宮素的前體肽中保護基Fmoc得到H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink?Amide-AM?Resin?茚三酮檢測顯陽性，將四氯丁酸/HOBT按摩爾量的3倍稱量好加入去完保護的前體肽H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM?Resin中加入適當的DMF使其攪拌均與反應1~2h?茚三酮檢測顯陰性，抽掉反應液加入適當甲醇使其攪拌均勻，抽掉甲醇真空抽干樹脂直至合成卡貝縮宮素線性肽樹脂；

步驟六、將裂解劑與步驟五獲得的卡貝縮宮素線性肽樹脂混合發生裂解反應，從而去除Rink?Amide-AM?Resin和卡貝縮宮素側鏈保護基，再依次通過沉降、離心、洗滌、干燥獲得卡貝縮宮素線性粗肽；

步驟七、將步驟六獲得干燥后的卡貝縮宮素線性粗肽研磨至成粉末狀，用二甲基亞砜（DMSO）溶解卡貝縮宮素粗肽至濃度為1mmol/20ml，從而獲得卡貝縮宮素線性粗肽溶液；

步驟八、向所述卡貝縮宮素線性粗肽溶液中滴加30%的稀氨水飽和碳酸鉀（K₂CO₃）調節卡貝縮宮素線性粗肽溶液pH至9~10，并將溫度調至50~60攝氏度，當pH至9~10、溫度調至50~60攝氏度時，立刻向環化溶液中加入0.2g/mmol的三-（2-羧乙基）-膦鹽酸鹽（TCEP），環化時間為1~2h；

步驟九、將步驟八中的卡貝縮宮素粗品溶液經過C18反相高效液相色譜柱分離純化，旋蒸凍干后，制得卡貝縮宮素。

2.?根據權利要求1所述的卡貝縮宮素的合成工藝，其特征在于：所述Rink?Amide-AM?linker與AM?Resin的投料比值為1.2~1.6：1，縮合時間為8~10h。

3.?根據權利要求1所述的卡貝縮宮素的合成工藝，其特征在于：所述步驟二和步驟四中采用1-羥基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二異丙基碳二亞胺（DIC）作為縮合劑，Rink?Amide?AM-Linker：N,N'-二異丙基碳二亞胺：1-羥基苯并三唑為1：1.0~1.2：1.0~1.2。

4.?根據權利要求1所述的卡貝縮宮素的合成工藝，其特征在于：所述AM?Resin起始替代度為1.65~1.75mmol/g。

5.?根據權利要求1所述的卡貝縮宮素的合成工藝，其特征在于：步驟六中的所述裂解劑為TFA：EDT：TIS：間甲酚按照92.5：2.5：2.5：2.5體積比混合而成，或者為TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚按照90：5：3：2體積比混合而成。